中文名：琥珀酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒

英文名：Succinate Dehydrogenase Assay Kit

英文別名：SDH Activity Assay Kit

純度：100T/96S

貨號(hào)：S486202

包裝：1kit

存儲(chǔ)溫度：-20°C儲(chǔ)存

產(chǎn)品介紹：

SDH（EC?1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體
內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。
SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm處具有特征吸收峰，通過(guò)600nm吸光度的變化，測(cè)定2,6-DCPIP的還原速度，代表SDH酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品組成

需自備的儀器和用品：?

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰 和蒸餾水。

操作步驟：

?一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）?

1. 組織樣本：稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一和 10μL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4℃ 11000g 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。?

2. 細(xì)胞或者細(xì)菌樣本：先收集 500 萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；之后加入 1mL 試劑一和 10μL 試劑 二，冰浴超聲波破碎細(xì)菌（功率 200W，超聲 3s，間隔 7s，總時(shí)間 5min）；然后 11000g，4℃，離心 10 min， 取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟?

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。?

2、 樣本測(cè)定

將試劑三和試劑四依次加入到 1.5mLEP 管中，37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）保溫 10min 后加入到微量 比色皿或 96 孔板再按表格依次加入各試劑，在 600nm 波長(zhǎng)下記錄 20s 時(shí)的初始吸光度 A1 和 1min20s 時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2，得到 ΔA 測(cè)定、ΔA 空白?？瞻坠苤恍铚y(cè) 1-2 次。?

三、SDH 活性的計(jì)算?

a.用微量比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。?

SDH活性（U/mg prot）=[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×109 ]÷(Cpr×V樣) ÷T =952.381×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷Cp??

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算 單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。?

SDH活性（U/g 質(zhì)量）=[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T =961.905×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷W?

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。?

SDH活性（U/104 cell）=[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×109 ]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T =1.924×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）

??V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；Cpr：樣本蛋 白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；109 ：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。?

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。?

DH活性（U/mg prot）=[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×109]÷(Cpr×V樣) ÷T =1587.302×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷Cpr??

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算 單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。?

SDH活性（U/g 質(zhì)量）=[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×109 ]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T =1603.175×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（U/104 cell）=[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反總×109 ]÷(V樣÷V樣總×500)÷T =3.207×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）??

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.6cm； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；Cpr：樣本蛋 白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；109 ：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。?

注意事項(xiàng)：

1、 測(cè)定過(guò)程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性失活。?

2、 若ΔA大于0.5（比色皿）/0.3（96孔板），需將酶液用酶提取液稀釋?zhuān)功小于0.5/0.3，可提高檢測(cè)靈敏度。 注意同步修改計(jì)算公式。

3、?由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：?

1、 取 0.1g 腎臟加入 1mL 試劑一和 10μL 試劑二，用冰浴勻漿器勻漿充分研磨，4℃11000g 離心 10min，取上清置 冰上。按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A1 測(cè)定-A2 測(cè)定=0.7838-0.6414=0.1424，ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=1.019-1.019=0，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：?

SDH 活性（U/g 質(zhì)量）=961.905×（ΔA 測(cè)定-ΔA 空白）÷W=1369.75 U/g 質(zhì)量。

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