中文名：大腸桿菌 Poly(A) 聚合酶
英文名：E. coli Poly(A) Polymerase
純度：醫(yī)藥級(jí)
貨號(hào)：E406458
包裝：100u
存儲(chǔ)溫度：-20°C儲(chǔ)存
產(chǎn)品介紹：
產(chǎn)品描述
通過(guò)加尾酶在mRNA 3' 末端引入Poly A尾，可增加mRNA的穩(wěn)定性，增加mRNA翻譯效率。使用加尾酶引入的Poly A尾的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)便易行，避免在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)引入過(guò)多的連續(xù)T堿基造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定等問題。
E. coli Poly (A) Polymerase 不依賴模板的存在，可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3′末端，即在 RNA 的 3′末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 RNA 的 3′末端加入 20~200 個(gè) A 堿基。Poly (A)結(jié)構(gòu)有助于提高 mRNA 的翻譯效率。?
本制品利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，并嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等，符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。
質(zhì)量要求
| 項(xiàng)目 | 標(biāo)準(zhǔn) | 方法 | | 外觀 | 澄明液體 | 目視檢查 | | 可見異物 | 符合規(guī)定 | 中國(guó)藥典2020版第四部第一法燈檢法(通則0904) | | pH值 | 7.0-8.0 | 中國(guó)藥典2020版第四部pH值測(cè)定法(通則0631) | | 活性 | 4.9KUml-5.1KU/ml | 加尾修飾及效率測(cè)定法 | | 純度 | ≥95% | 中國(guó)藥典2020版第四部高效液相色譜法(通則0512) | | 核酸內(nèi)切酶殘留 | 004-DNA 的降解不超過(guò)10% | SU酶與004-DNA.37C孵育3h | | 核酸外切酶殘留 | 019 HindⅢ-DNA的降解不超過(guò)10% | SU酶與019 HindⅢ-DNA,37°C孵育3h | | RNA酶殘留 | 293-RNA的降解不超過(guò)10% | 5U酶與293-RNA.37°C孵育1h | | 細(xì)菌內(nèi)毒素含量 | ≤10 EU/mg | 中國(guó)藥典2020版第四部凝膠限度試驗(yàn)法(通則1143) | | 宿主DNA殘留 | ≤100 pg/mg | 熒光定量PCR法 | | 宿主蛋白殘留 | ≤50 ppm | 中國(guó)藥典2020版第四部菌體蛋白殘留量測(cè)定法(通則 3412) | | 支原體 | 陰性 | 支原體檢測(cè)試劑盒 | | 重金屬殘留 | ≤10 ppm | 中國(guó)藥典2020版第四部重金屬檢查法(通則0821) |
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遵循以下規(guī)范生產(chǎn)
1. ISO 9001:2015, certified facility。
2. 《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》國(guó)家藥品監(jiān)督管理局。
3. 《人用基因治療總論-中國(guó)藥典 2020》國(guó)家藥典委。
4. USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細(xì)胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
5. USP Chapter <92>, Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。
6.Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細(xì)胞或基因治療藥物的生物來(lái)源原料。
產(chǎn)品用途
1.? 用于 RNA 3′末端標(biāo)記。
2.? 為 RNA 添加 Poly(A)尾，用于克隆或親和純化。比如將 miRNA 添加 Poly (A)，為 cDNA 合成提供 oligo-dT 引物結(jié)合位點(diǎn)。
3.? 提高 RNA 在真核細(xì)胞中的翻譯效率。
保存體系
20mM Tris-HCl; 300mM NaCl; 1mM DTT; 1mM EDTA; 0.1%TritonX-100; 50% (v/v) Glycerol, pH7.5。?
應(yīng)用實(shí)例
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完整mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP蛋白，加帽酶與帽類似物對(duì)比
注意事項(xiàng)
1. 熱失活條件：65℃，20 min。
2. 該酶只能以 RNA 為底物。
3. 該酶將 AMP 添加到 RNA 的3′末端具有較高的選擇性，并不會(huì)在所有 RNA 分子中添加相同長(zhǎng)度的 Poly (A)。
4. 該酶使用 M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液，也可以進(jìn)行反應(yīng)。
5. 該酶需要 Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子才具有活性。
6. RNA 加 A 尾長(zhǎng)度受酶量、ATP 和反應(yīng)時(shí)間等因素影響，不同的實(shí)驗(yàn)需要加 A 的量會(huì)有所不同，可通過(guò)減少反應(yīng)時(shí)間來(lái)調(diào)整加 A 的長(zhǎng)度，該酶在 37°C 反應(yīng) 30 分鐘時(shí)可加約 30 個(gè) A 堿基，1 小時(shí)可加約 100 個(gè) A 堿基。
7. EDTA 抑制該酶活性。若停止反應(yīng)，可通過(guò)添加 EDTA 至終濃度 10mM，或直接對(duì)其進(jìn)行純化。
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