中文名：PMA（疊氮溴化丙錠）， 20 mM in water

英文名：PMA (propidium azide bromide), 20 mm in water

貨號(hào)：P598082

包裝：100μl

存儲(chǔ)溫度：避光,-20°C儲(chǔ)存

產(chǎn)品介紹：

PMA是一種高親和性的DNA結(jié)合染料，該染料本身具有微弱的熒光，但與核酸結(jié)合后可以發(fā)出更為明亮的熒光。它尤其與雙鏈DNA具有高親和性。PMA不具有細(xì)胞膜滲透性，因此可選擇性地修飾膜受損的死細(xì)胞的 DNA。PMA修飾的DNA經(jīng)藍(lán)光（~464 nm）光解后，PMA上的光反應(yīng)性疊氮基轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性氮烯自由基，與DNA結(jié)合位點(diǎn)附近的任何烴部分反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)氮碳鍵，從而導(dǎo)致永久性 DNA 修飾（圖1）。該修飾過(guò)程會(huì)使DNA不溶，并使其在隨后的基因組DNA提取過(guò)程中與細(xì)胞碎片一起丟失，進(jìn)而阻礙死細(xì)胞中目標(biāo)DNA的PCR擴(kuò)增。殘留在溶液中未結(jié)合的PMA，在強(qiáng)光照射下與水分子反應(yīng)分解成無(wú)交聯(lián)活性的羥胺化合物，使羥胺不再能夠共價(jià)結(jié)合DNA，從而不影響PCR擴(kuò)增。這個(gè)特性使得 PMA 可以通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCR（qPCR）的手段，檢測(cè)多種樣本類型包括：細(xì)菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核細(xì)胞；與qPCR、NGS、Sanger測(cè)序和LAMP技術(shù)相結(jié)合，廣泛應(yīng)用在食品和水安全和環(huán)境測(cè)試中。

產(chǎn)品參數(shù)：

橙紅色液體； Ex (pH 3) = 464 nm (before photolysis)； Ex /Em (after photocrosslinking to nucleic acid) = 510/610 nm

注意事項(xiàng)：

1. 使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2. 試劑盒組分中含有熒光染料，使用及保存過(guò)程中注意避光。 3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

應(yīng)用范圍：

細(xì)菌核酸染色

使用方法：
使用前注意事項(xiàng)：
1. PMA 根據(jù)細(xì)胞膜通透性區(qū)分死菌和活菌。許多殺死細(xì)菌的方法會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，因此適用于 PMA 檢測(cè)。 但有些方法，如紫外線照射，可能不會(huì)立即導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂。因此，在選擇 PMA 檢測(cè)之前，需先進(jìn)行文獻(xiàn)檢索和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定是否適用于您選擇的細(xì)菌類型和殺傷方法。
2. PMA 處理完細(xì)菌后需要進(jìn)行光解，以使染料與死細(xì)胞 DNA 共價(jià)結(jié)合。光解操作可以使用藍(lán)色或白色光源。一般來(lái)說(shuō)，燈越亮，光解步驟的效率就越高。非 LED 燈（如鹵素?zé)簦┛赡軙?huì)加熱您的樣本并對(duì)分析產(chǎn)生負(fù)面影響，照射時(shí)需要使用冰塊對(duì)樣品降溫處理。
3. 樣本可以在光解后冷凍保存。若在進(jìn)行 PMA 處理光解之前冷凍樣本可能會(huì)損壞細(xì)胞膜并產(chǎn)生假陰性結(jié)果。如需在檢測(cè)之前冷凍樣本，建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。
4. PMA 的部分作用機(jī)制是通過(guò)沉淀從樣本中去除 PMA 共價(jià)修飾的 DNA；因此，在提取基因組 DNA 時(shí)，需使用相同體積的基因組 DNA 洗脫液，進(jìn)行體積歸一化處理。陽(yáng)性對(duì)照可以使用活細(xì)胞的基因組 DNA。
5. 為了驗(yàn)證 PMA 在測(cè)試樣本中的有效性，可對(duì)比同處理樣本-/+PMA 之間的 Ct (dCt)變化。

實(shí)驗(yàn)材料（自備）：
①光源（用于 PMA 修飾 DNA 后的光解步驟）；②細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒；③配套的 qPCR Mix 試劑盒；④對(duì)應(yīng)樣本類型的有效 qPCR 引物；
實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 吸取 10 μL 菌液于液體 LB 培養(yǎng)基，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間，使細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600 ≈ 1.0)；
注：培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整。
2. 取活細(xì)菌兩份，每份 400 μL，置于干凈離心管中。
3. （建議）制備死細(xì)菌。若需要死細(xì)菌作為對(duì)照，可將活細(xì)菌放入水浴鍋中 95℃加熱 5 min，或 58℃加熱 3 h，具體操作根據(jù)樣本類型自行選擇，即可獲得死細(xì)菌。死細(xì)菌的后續(xù)操作同活細(xì)菌。
4. 兩份活細(xì)菌，一份不用 PMA 處理，一份用 25 μM PMA 處理（處理不同類型或不同來(lái)源細(xì)菌的最適 PMA 濃度需查閱相關(guān)文獻(xiàn)）。
5. 將 PMA 處理的樣本室溫置于搖床上，避光孵育 10 min，使染料與樣本充分混勻。
6. 將樣品曝光，可以使用藍(lán)色或白色光源，照射時(shí)間需自行摸索。例如，可用 60 W 的藍(lán)光燈，照射 15 min。
注：① 若使用鹵素?zé)?，我們建議將 PMA 處理的樣本管放在距離光源 20 cm 處的冰塊上。冰塊應(yīng)放在透明托盤(pán)中，調(diào)整光源使其直接指向樣品，光解 5-15 min；② 若直接用環(huán)境中獲取的細(xì)菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由于環(huán)境樣本的復(fù)雜性或渾濁度，需適當(dāng)延長(zhǎng)光解時(shí)間。

7. 處理和未處理的活細(xì)菌 5000 ×g，離心 10 min，去上清。
8. 根據(jù)樣本類型選擇合適的基因組 DNA 提取試劑盒，洗脫 DNA 時(shí)，各組樣本使用相同的洗脫體積。
注：DNA 提取步驟參考所用試劑盒的說(shuō)明書(shū)。PMA 的部分作用機(jī)制是通過(guò)沉淀從樣品中去除 PMA 結(jié)合的 DNA；因此，在提取基因組 DNA 時(shí)，各組應(yīng)使用相同體積的基因組 DNA 洗脫液，進(jìn)行體積歸一化處理（死菌和活菌提取基因組 DNA 量不一致，因此兩者濃度相差明顯）。
9. 按如下體系制備反應(yīng)混合液：

注：① 商用 DNA 提取試劑盒提取的 DNA，qPCR 模板以 2 μL 作為起始優(yōu)化體積；② 模板體積不得超過(guò)最終反應(yīng)體積的10%；③ 模板濃度：gDNA 做模板時(shí)，通常 1-10 ng 即可；④ PCR 引物的終濃度通常為 0.4 μM，可以得到較好的結(jié)果，反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在 0.2 - 1 μM 范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
10. 輕輕渦旋混勻反應(yīng)混合液，轉(zhuǎn)移固定體積至 PCR 管。
11. 測(cè)試程序（根據(jù)自備 qPCR Mix 試劑盒程序進(jìn)行程序設(shè)定）。
12. 數(shù)據(jù)分析
使用活細(xì)菌和死細(xì)菌作為對(duì)照，分析計(jì)算樣本中活細(xì)胞數(shù)。建議開(kāi)始 PMA qPCR 活細(xì)菌檢測(cè)前，先驗(yàn)證引物及 PCR 程序是否合適。死、活細(xì)菌對(duì)照 dCt 計(jì)算
（1） qPCR 結(jié)束后，使用儀器軟件計(jì)算每個(gè)樣本的 Ct 值。
（2） 通過(guò)計(jì)算每個(gè)對(duì)照細(xì)菌的 dCt 的方式，判斷 PMA 是否成功抑制了死細(xì)菌 DNA 的擴(kuò)增，計(jì)算如下：
dCt 活 = Ct(活, PMA 處理) - Ct(活, PMA 未處理)
dCt 死 = Ct(死, PMA 處理) - Ct(死, PMA 未處理)
（3） 活細(xì)菌的 dCt 期望值接近于 0 ± 1，這表明 PMA 不會(huì)影響活細(xì)胞 DNA 的擴(kuò)增；
（4） 死細(xì)菌的 dCt 期望值大于 4（dCt 為 4 表示減少了約 16 倍，即去除了 94% 的死細(xì)菌 DNA；dCt 為 8 表示減少了約250 倍，即去除了 99.6%的死細(xì)菌 DNA）。
（5） 死細(xì)菌的 dCt 取決于許多因素，包括：菌株系/細(xì)胞類型；細(xì)菌被殺死方式；PMA 使用濃度；擴(kuò)增序列長(zhǎng)度。
13. 活細(xì)菌占比計(jì)算
如果死、活細(xì)菌對(duì)照結(jié)果正常，可以進(jìn)入樣本中活細(xì)菌占比計(jì)算。
（1） 計(jì)算樣本的 dCt 值：
dCt 樣本 = Ct(樣本, PMA 處理) - Ct(樣本, PMA 未處理)
（2） 轉(zhuǎn)換 dCt 值為活細(xì)菌比例：
PMA 抑制倍數(shù) = 2（樣本 dCt）
活細(xì)菌% = 100 / PMA 抑制倍數(shù)
14. 計(jì)算活細(xì)菌的絕對(duì)數(shù)量
如果想計(jì)算樣本中活細(xì)菌的絕對(duì)數(shù)量☆，需要用已知數(shù)量的目標(biāo)菌的基因組 DNA 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。建議稀釋的幾組基因組濃度在 qPCR 分析體系的范圍內(nèi)。
（1） 以 Ct 值為縱坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（2） 計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣本的拷貝數(shù)：
Ct = 斜率 * 細(xì)胞數(shù) + y 軸截距 （y = mx + b）
細(xì)菌數(shù)樣本 = （Ct – y 軸截距） / 斜率
注：純化過(guò)程中活細(xì)菌 DNA 未損失。

示例：

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