人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基
hUCMSC Serum Free Medium
一、產(chǎn)品基本信息
產(chǎn)品名稱 | Applied Cell ? 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基 |
貨 號(hào) | AC-1001043 |
規(guī) 格 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基450mL，添加劑50mL |
運(yùn)輸保存條件 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基2-8℃，添加劑-20℃至-80℃；混合后2-8℃ |
使用范圍 | 人臍帶來(lái)源的干細(xì)胞原代分離、擴(kuò)增與傳代培養(yǎng) |
保質(zhì)期 | 12個(gè)月 |
二、產(chǎn)品簡(jiǎn)介
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基是埃澤思生物（Applied Cell?）自主研發(fā)的一款無(wú)外源動(dòng)物成分的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。可應(yīng)用于人臍帶組織來(lái)源的干細(xì)胞的原代分離、擴(kuò)增與傳代培養(yǎng)，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內(nèi)毒素水平遠(yuǎn)低于中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)過(guò)程遵循ISO9001體系,并符合GMP指導(dǎo)原則。
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基主要成分：氨基酸，維生素、無(wú)機(jī)鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、微量元素，細(xì)胞因子等。
三、產(chǎn)品特性
l 無(wú)外源動(dòng)物蛋白成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風(fēng)險(xiǎn)。
l 全程無(wú)血清生產(chǎn)，極大降低批次間差異。
l 可用于原代分離，且培養(yǎng)過(guò)程無(wú)需包被培養(yǎng)板。
l 擴(kuò)增效率高，24h左右增殖翻倍，節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間。
l 內(nèi)毒素<0.06EU/ml，遠(yuǎn)低于中國(guó)藥典水平
四、產(chǎn)品內(nèi)容
組分 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 運(yùn)輸 |
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 | 450mL | 1瓶 | 冰袋 |
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清添加劑 | 50mL | 1瓶 | 干冰 |
五、相關(guān)產(chǎn)品
無(wú)血清細(xì)胞凍存液（治療級(jí)）（Applied Cell?: Cat. no.AC-1001006）
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Applied Cell?: Cat. no.AC-2001003） 細(xì)胞消化液（Applied Cell?: Cat. no. AC-1001024）
六、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基配制
1. 37℃快速解凍人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清添加劑，快速溶解時(shí)不易破壞添加劑中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，時(shí)間大致為10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即儲(chǔ)存于-20℃至-80℃，避免反復(fù)凍融 。
2. 將添加劑以10%比例加入到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，即為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（AC-1001043PRF）。混合后培養(yǎng)基可在2-8℃ 穩(wěn)定儲(chǔ)存2-3周，不建議使用已配制超過(guò)3周的培養(yǎng)基。
3. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基可直接應(yīng)用于人類臍帶組織來(lái)源的干細(xì)胞的原代分離、擴(kuò)增與傳代培養(yǎng)。
4. 預(yù)先高溫高壓滅菌處理剪刀，鑷子等實(shí)驗(yàn)器械。
5. 預(yù)先紫外滅菌超凈臺(tái)/安全柜等實(shí)驗(yàn)環(huán)境。
七、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無(wú)菌條件下操作)
1. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代分離（貼壁法）
臍帶簡(jiǎn)介：臍帶包括臍帶血、華通氏膠、兩根動(dòng)脈、一根靜脈，所有這些結(jié)構(gòu)被臍帶上皮（內(nèi)襯膜）包裹。臍帶是間充質(zhì)干細(xì)胞的主要來(lái)源，其中華通氏膠只含有間充質(zhì)干細(xì)胞一種干細(xì)胞，是最常用來(lái)分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。而內(nèi)襯膜則含有至少兩種干細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞，這兩種干細(xì)胞也是細(xì)胞治療的主要來(lái)源。
以下方法為從華通氏膠中分離高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞詳細(xì)步驟：
1.1. 無(wú)菌收集長(zhǎng)度約10cm的臍帶，迅速將臍帶放到含有人臍帶脂肪保存液（AC-1001016）的50mL離心管中。在4℃條件下快速運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在4h內(nèi)處理完成全部過(guò)程。
1.2. 將臍帶置于生物安全柜中冰盒里放置的直徑10cm培養(yǎng)皿中。用預(yù)冷的PBS多次清洗臍帶，去除殘留的血液即止。以下分離組織塊的過(guò)程確保全程臍帶浸泡在預(yù)冷PBS中保持濕潤(rùn)。
1.3. 使用剪刀徑向剖開臍帶，將血管以及周圍的華通氏膠暴露出來(lái)。
1.4. 用解剖刀將華通氏膠與血管分離，用鑷子夾住血管，整條剝離，中間白色部分即華通氏膠（具體人類臍帶結(jié)構(gòu)參見圖1） 。
1.5. 用剪刀將華通氏膠剪成0.5-1cm見方的薄片組織塊，盡量不要太厚。最后剩余的臍帶上皮（內(nèi)襯膜）組織 棄除。
注意：組織塊盡量接近片狀，增大與培養(yǎng)皿接觸面積，提高細(xì)胞爬出率
1.6. 每個(gè)直徑10cm的培養(yǎng)皿中放置10-15個(gè)組織塊，加入6mL 完全培養(yǎng)基。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 不同原代分離體系初始組織塊數(shù)量以及細(xì)胞爬出率見表1。
注意：①為促進(jìn)組織塊貼壁，培養(yǎng)基不能加太多，否則組織塊容易漂起
②為促進(jìn)組織塊貼壁，72小時(shí)內(nèi)不能搖晃培養(yǎng)皿，72小時(shí)次換液也是同理。
培養(yǎng)們直徑 | 初始組織塊數(shù)量 | 細(xì)胞爬出組織塊數(shù)量 | 細(xì)胞爬出率 |
10cm | 16.9 | 11.8 | 69.8% |
表1 臍帶組織塊粘壁數(shù)據(jù)（平均數(shù)據(jù)）
1.7. 每72小時(shí)換液。一般5-7天可以看見貼壁組織塊附近有細(xì)胞爬出，12-15天細(xì)胞匯合度達(dá)到70%以上，即可準(zhǔn)備傳代。
1.8. 細(xì)胞傳代時(shí)，用槍頭吸掉組織塊以及原有培養(yǎng)基，加入5mlPBS清洗一次。每個(gè)直徑10ml，的培養(yǎng)皿中加入5ml的細(xì)胞消化液（AC-1001024 ），搖勻覆蓋皿底，37℃恒溫箱2-3min或室溫3-5min孵育。
1.9. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿底，輕輕敲打皿底，細(xì)胞呈細(xì)沙狀脫落，加入同體積完全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細(xì)胞完全脫落下來(lái)，將細(xì)胞懸液收集到15mL離心管中，300×g離心5min。
1.10. 用完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，此時(shí)的細(xì)胞稱為P0代。相關(guān)代次預(yù)期收獲細(xì)胞量請(qǐng)參考表2。
1.11. 根據(jù)本公司統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，10cm長(zhǎng)的臍帶，約可以收獲1.24×107個(gè)P0代細(xì)胞，一根臍帶長(zhǎng)度 大約20cm，約可以收獲2.5×107個(gè)P0代細(xì)胞。
1.12. 根據(jù)本公司檢測(cè)，按1:8傳代，細(xì)胞形態(tài)在P10代內(nèi)不發(fā)生變化。P10代以上細(xì)胞沒有實(shí)際應(yīng)用意義，暫不檢測(cè)。
1.13. 臍帶兩端的組織原代分離效率有較大差異，近胎盤端分離效率要高于近胎兒端10-30%。
| P0 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 |
細(xì)胞數(shù)量 | 1.2×107 | 9.6×107 | 7.7×108 | 6.2×109 | 5.0×1010 | 4.0×1011 |
表2 10cm長(zhǎng)的臍帶P0-P5代預(yù)計(jì)收獲細(xì)胞數(shù)量（1:8傳代）
2. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)
2.1. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)到90%，即可準(zhǔn)備傳代;
2.2. 吸掉培養(yǎng)瓶/皿中的培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，加入適量的細(xì)胞消化液（AC-1001024）覆蓋瓶/皿底，37℃恒溫箱2-3min或室溫3-5min孵育。
2.3. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離瓶/皿底，輕輕敲打瓶/皿底，細(xì)胞呈細(xì)沙狀脫落，加入等倍體積的完全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細(xì)胞脫落下來(lái)，并輕輕吹打成單細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集到適當(dāng)?shù)碾x心管中，室溫300×g 離心5min。
2.4. 棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，按照比例進(jìn)行傳代或計(jì)數(shù)后按照1.1-1.45×104個(gè)/cm2密度進(jìn)行接種。均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO2 條件下培養(yǎng)。相關(guān)數(shù)據(jù)請(qǐng)見表3。
注意：細(xì)胞規(guī)模生產(chǎn)建議1:5-1:8傳代，一般72小時(shí)可以達(dá)到90%以上匯合度。
| 清洗PBS體積 | 消化液體積 | 培養(yǎng)基體積 | 接種細(xì)胞數(shù)量 |
10cm dish | 5ml | 5ml | 10ml | 6.0-8.0×105 |
T25培養(yǎng)瓶 | 3ml | 3ml | 5ml | 2.7-3.7×105 |
T75培養(yǎng)瓶 | 8ml | 8ml | 15ml | 0.8-1.1×106 |
T175培養(yǎng)瓶 | 18ml | 18ml | 35ml | 2.0-3.0×106 |
表3 不同體系建議細(xì)胞接種數(shù)量及加液量
3. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存
3.1. 同步驟2.1；
3.2. 同步驟2.2；
3.3. 同步驟2.3；
3.4. 棄上清，用4℃保存的無(wú)血清細(xì)胞凍存液（治療級(jí)）（AC-1001006）重懸細(xì)胞，取部分細(xì)胞計(jì)數(shù)。
注意：無(wú)血清細(xì)胞凍存液即拿即用，用完之后盡快放回4℃冰箱，以防室溫放置太久，影響質(zhì)量。
3.5. 計(jì)數(shù)后用無(wú)血清細(xì)胞凍存液（治療級(jí)）（AC-1001006）調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至建議凍存密度1-5×106個(gè)/mL，每支凍存管（需提前做好標(biāo)記）分裝1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速凍存。
3.6. -80℃放置過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。
4. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇
4.1. 從液氮中取出凍存的hUMSC，37℃水浴快速融解。
4.2. 在生物安全柜或超凈臺(tái)中，先在15mL離心管中加入5 mL 37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，將解凍后的細(xì)胞懸液緩慢滴加到離心管中。
4.3. 300×g離心3min，吸掉上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至建議接種濃度（參考表3）。
4.4. 將細(xì)胞懸液均勻滴加到培養(yǎng)瓶/皿中，水平十字振動(dòng)培養(yǎng)瓶/皿使細(xì)胞均勻。置于37℃，5% CO2 條件下培養(yǎng)24小時(shí)后觀察細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)。
4.5. 細(xì)胞無(wú)異常即可同時(shí)更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
4.6. 初次換液后每 48-72小時(shí)更換培養(yǎng)液直至傳代。
八、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞模式圖
九、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖以及分化檢測(cè)
十、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式檢測(cè)
十一、質(zhì)量控制
檢驗(yàn)項(xiàng)目 Test Catagories | 參考數(shù)據(jù) Reference Data |
外觀 Physical APPearance | 無(wú)色液體 Colorless liquid |
澄清度 Clarity | 澄清 Clear |
pH值 Ph Value | 7.0-7.4 |
滲透壓 Osmolality | 270-340 （mosm/KgH2O） |
細(xì)菌內(nèi)毒素 Endotoxin | 小于0.06 EU/ml |
無(wú)菌 Sterility | 無(wú)菌 Sterility |
支原體 Mycoplasma | 0.11um過(guò)濾，支原體試驗(yàn)為陰性 The mycoplasma test was negative after 0.11um filtration |
細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn) Cell growth test | 細(xì)胞為梭形，呈指紋狀或螺旋狀生長(zhǎng) The cells are spindle - shaped, fingerlike or spiral |
關(guān)鍵字： 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基;MSC培養(yǎng)基;間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基;干細(xì)胞培養(yǎng)基;埃澤思培養(yǎng)基;
埃澤思生物總部位于上海，公司取名Applied Cell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治aize 療、再生埃澤思生物總部位于上海，公司取名AppliedCell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)提供核心原料，以及研發(fā)服務(wù)（CRO ）和生物藥委托開發(fā)生產(chǎn)服務(wù)（CDMO）的生物科技公司。目前公司產(chǎn)品已經(jīng)涵蓋干細(xì)胞、免疫細(xì)胞治療全流程試劑原料。其中核心產(chǎn)品已經(jīng)完成美國(guó)FDADMF備案以及國(guó)家藥品評(píng)審中心（CDE）藥物原輔料備案，是國(guó)內(nèi)資質(zhì)最為齊全的細(xì)胞治療原料供應(yīng)商之一。目前，公司已與國(guó)內(nèi)6家細(xì)胞治療企業(yè)進(jìn)行細(xì)胞治療一類新藥聯(lián)合申報(bào)，一項(xiàng)日本一類新藥聯(lián)合申報(bào)。