本品為百合科植物川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂貝母Fritillaria delavayi Franch.、太白貝母Fritillaria taipaiensis P. Y. Li或瓦布貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsiavar. wabuensis(S. Y. Tanget S. C. Yue)Z. D. Liu,S. Wang et S. C. Chen的干燥鱗莖。按性狀不同分別習稱“松貝”、“青貝”、“爐貝”和“栽培品”。夏、秋二季或積雪融化后采挖,除去須根、粗皮及泥沙,曬干或低溫干燥。 【性狀】松貝 呈類圓錐形或近球形,高0.3~0.8cm,直徑0.3~0.9cm。表面類白色。外層鱗葉2瓣,大小懸殊,大瓣緊抱小瓣,未抱部分呈新月形,習稱“懷中抱月”;頂部閉合,內(nèi)有類圓柱形、頂端稍尖的心芽和小鱗葉1~2枚;先端鈍圓或稍尖,底部平,微凹入,中心有1灰褐色的鱗莖盤,偶有殘存須根。質(zhì)硬而脆,斷面白色,富粉性。氣微,味微苦。 青貝 呈類扁球形,高0.4~1.4cm,直徑0.4~1.6cm。外層鱗葉2瓣,大小相近,相對抱合,頂部開裂,內(nèi)有心芽和小鱗葉2~3枚及細圓柱形的殘莖。 爐貝 呈長圓錐形,高0.7~2.5cm,直徑0.5~2.5cm。表面類白色或淺棕黃色,有的具棕色斑點。外層鱗葉2瓣,大小相近,頂部開裂而略尖,基部稍尖或較鈍。 栽培品 呈類扁球形或短圓柱形,高0.5~2cm,直徑1~2.5cm。表面類白色或淺棕黃色,稍粗糙,有的具淺黃色斑點。外層鱗葉2瓣,大小相近,頂部多開裂而較平。 【鑒別】(1)本品粉末類白色或淺黃色。 松貝、青貝及栽培品 淀粉粒甚多,廣卵形、長圓形或不規(guī)則圓形,有的邊緣不平整或略作分枝狀,直徑5~64μm,臍點短縫狀、點狀、人字狀或馬蹄狀,層紋隱約可見。表皮細胞類長方形,垂周壁微波狀彎曲,偶見不定式氣孔,圓形或扁圓形。螺紋導管直徑5~26μm。 爐貝 淀粉粒廣卵形、貝殼形、腎形或橢圓形,直徑約至60μm,臍點人字狀、星狀或點狀,層紋明顯。螺紋導管和網(wǎng)紋導管直徑可達64μm。 (2) 取本品粉末10g,加濃氨試液10ml,密塞,浸泡1小時,加二氯甲烷40ml,超聲處理1小時,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇0.5ml使溶解,作為供試品溶液。另取貝母素乙對照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取供試品溶液1~6μl、對照品溶液2μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液-水(18∶2∶1∶0.1)為展開劑,展開,取岀,晾干,依次噴以稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。 ?。?) 聚合酶鏈式反應-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法。 模板DNA提取 取本品0.1g,依次用75%乙醇1ml、滅菌超純水1ml清洗,吸干表面水分,置乳缽中研磨成極細粉。取20mg,置1.5ml離心管中,用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA[加入緩沖液AP1 400μl和RNA酶溶液(10mg/ml)4μl,渦漩振蕩,65℃水浴加熱10分鐘,加入緩沖液AP2 130μl,充分混勻,冰浴冷卻5分鐘,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘14000轉(zhuǎn))10分鐘;吸取上清液轉(zhuǎn)移入另一離心管中,加入1.5倍體積的緩沖液AP3/E,混勻,加到吸附柱上,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn))1分鐘,棄去過濾液,加入漂洗液700μl,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))30秒,棄去過濾液;再加入漂洗液500μl,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))30秒,棄去過濾液;再離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn))2分鐘,取出吸附柱,放入另一離心管中,加入50μl洗脫緩沖液,室溫放置3~5分鐘,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))1分鐘,將洗脫液再加入吸附柱中,室溫放置2分鐘,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))1分鐘],取洗脫液,作為供試品溶液,置4℃冰箱中備用。另取川貝母對照藥材0.1g,同法制成對照藥材模板DNA溶液。 PCR-RFLP反應 鑒別引物:5'CGTAACAAGGTTT-CCGTAGGTGAA3'和5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'。PCR反應體系:在200μl離心管中進行,反應總體積為30μl,反應體系包括10×PCR緩沖液3μl,二氯化鎂(25mmol/L)2.4μl,dNTP(10mmol/L)0.6μl,鑒別引物(30μmol/L)各0.5μl,高保真Taq DAN聚合酶(5U/μl)0.2μl,模板1μl,無菌超純水21.8μl。將離心管置PCR儀,PCR反應參數(shù):95℃預變性4分鐘,循環(huán)反應30次(95℃30秒,55~58℃30秒,72℃30秒),72℃延伸5分鐘。取PCR反應液,置500μl離心管中,進行酶切反應,反應總體積為20μl,反應體系包括10×酶切緩沖液2μl,PCR反應液6μl,Sma I(10U/μl)0.5μl,無菌超純水11.5μl,酶切反應在30℃水浴反應2小時。另取無菌超純水,同法上述PCR-RFLP反應操作,作為空白對照。 電泳檢測 照瓊脂糖凝膠電泳法(通則0541),膠濃度為1.5%,膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed;供試品與對照藥材酶切反應溶液的上樣量分別為8μl,DNA分子量標記上樣量為1μl(0.5μg/μl)。電泳結(jié)束后,取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中,在與對照藥材凝膠電泳圖譜相應的位置上,在100~250bp應有兩條DNA條帶,空白對照無條帶。
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