碧云天生產(chǎn)的支原體PCR檢測(cè)試劑盒(Mycoplasma PCR Detection Kit)，是一種通過(guò)巢式PCR法(Nested PCR)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞等生物材料中是否存在支原體污染的檢測(cè)試劑盒。
支原體(Mycoplasma)是最小、 的原核生物。支原體有如下特征：支原體無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，所以針對(duì)細(xì)胞壁的許多常見(jiàn)的抗生素，如青霉素或β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素對(duì)支原體無(wú)效；支原體大小介于細(xì)菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過(guò)0.22μm濾器，常規(guī)的過(guò)濾對(duì)支原體無(wú)效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營(yíng)養(yǎng)，所以通常吸附或散落在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。支原體的這些特征使細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中存在支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)，細(xì)胞的支原體污染已經(jīng)成為一個(gè) 性的普遍問(wèn)題。
支原體污染可能會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的狀態(tài)，使細(xì)胞的基因表達(dá)、代謝特征發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減緩、分化和死亡異常，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。這些影響因素會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性和一致性，因此支原體污染的檢測(cè)非常重要。
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌、酵母或霉菌污染在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下通常不可見(jiàn)，必須通過(guò)特定的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)支原體污染的常用方法有支原體分離培養(yǎng)、ELISA、發(fā)光法等特殊的生化檢測(cè)以及DNA熒光染色檢測(cè)等。上述檢測(cè)方法中，大多操作步驟相對(duì)比較煩瑣、靈敏性不高、不能區(qū)分支原體種類(lèi)、需要特殊儀器或所需時(shí)間較長(zhǎng)。而PCR法操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單便捷，PCR擴(kuò)增后通過(guò)電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據(jù)擴(kuò)增片段的大小大致預(yù)測(cè)至少11種所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測(cè)序以確定具體的支原體種屬。
本支原體PCR檢測(cè)試劑盒是利用兩對(duì)引物通過(guò)巢式PCR法特異性擴(kuò)增支原體基因組DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的高靈敏度特異性檢測(cè)的。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)(space region)在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區(qū)。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區(qū)DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)F1/R1引物，用于擴(kuò)增16S和23S之間的間隔區(qū)，這就是巢式PCR的 輪PCR (1st PCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條R2引物進(jìn)行巢式PCR的 輪PCR (2nd PCR)。通過(guò)巢式PCR可以大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。本產(chǎn)品的檢測(cè)原理請(qǐng)參考圖1。

圖1. 支原體PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理圖。

本試劑盒可快速、有效、高靈敏度地檢測(cè)支原體污染。
本試劑盒提供了陽(yáng)性對(duì)照Control template，便于確定PCR檢測(cè)是否能正常工作，及樣品中是否存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。
如果發(fā)現(xiàn)有支原體污染，建議更換無(wú)污染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。如果有必要預(yù)防或去除支原體，可以使用專(zhuān)用的支原體預(yù)防或去除試劑(C0288、C0290、C0292、C0293)。
如果用于20μl的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒共可以進(jìn)行250次檢測(cè)。如果用于50μl的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測(cè)。