細(xì)胞簡介
人胚腎細(xì)胞株293插入SV40 T-抗原基因后產(chǎn)生的高轉(zhuǎn)染效率的衍生株稱為293T。該細(xì)胞最初的名字293tsA1609neo,攜帶SV40復(fù)制序列,被廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。
運(yùn)輸和保存
1.1 mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,收貨后-80℃冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇。若發(fā)現(xiàn)干冰已經(jīng)揮發(fā)干凈、凍存管蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。
2.T25瓶培養(yǎng)的細(xì)胞常溫發(fā)貨,收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
培養(yǎng)瓶細(xì)胞接收后的處理
1.收到細(xì)胞后,75%酒精消毒瓶壁,拆下封口膜,放入37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中靜置3-4 h,以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液體溢出及細(xì)胞有污染,請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2.請(qǐng)?jiān)陲@微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照,10倍和20倍各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,作為售后依據(jù)。
3.細(xì)胞收貨脫落:293T細(xì)胞貼壁能力弱,收貨如有大面積脫落的細(xì)胞團(tuán)為正?,F(xiàn)象。若細(xì)胞在快遞運(yùn)輸途中因振動(dòng)脫落,先將培養(yǎng)瓶放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中靜置3-6 h,讓少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。若仍有脫落聚集的細(xì)胞,則 (1) 收集所有細(xì)胞懸液,1000 rpm離心5 min,保留沉淀;(2) 添加胰蛋白酶消化液0.5 mL至離心管中,重懸沉淀,置于37℃消化1-2 min左右;(3) 向離心管內(nèi)加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化;(4) 1000 rpm,離心5 min,丟棄上清,用5 mL完全培養(yǎng)基(補(bǔ)加1-5% FBS,促進(jìn)貼壁)重懸沉淀,接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi);(5) 待細(xì)胞完全貼壁后,培養(yǎng)觀察;之后按照換液頻率更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
4.收貨細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代:在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài),若細(xì)胞生長密度在60%以下,可去除培養(yǎng)瓶中的灌液培養(yǎng)基,加入新配制的完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)80%-90%以上,可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。
5.運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng))不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,請(qǐng)換用合適的新鮮培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。
凍存細(xì)胞接收后的處理
收貨后-80℃冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇。
細(xì)胞復(fù)蘇:將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管置于37℃水浴中迅速搖晃解凍,回溫后噴以75 %酒精并擦拭之,移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。將凍存管中細(xì)胞加入到含4-6 mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。1000 rpm離心3-5 min,棄去上清液,完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)箱中孵育。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
293T培養(yǎng)注意事項(xiàng)
1.293T貼壁能力較弱,加液、換液、洗滌時(shí),須動(dòng)作輕柔,避免用液體直沖細(xì)胞,會(huì)造成細(xì)胞脫落。細(xì)胞生長不能過密,過密細(xì)胞容易脫落,脫落下來的細(xì)胞可以通過離心收集,使用胰酶消化后繼續(xù)培養(yǎng)。
2.293T細(xì)胞狀態(tài)直接影響病毒包裝效率。當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多、細(xì)胞增殖速度減緩、細(xì)胞貼壁能力非常弱(輕柔換液也能導(dǎo)致細(xì)胞半數(shù)脫落)時(shí),說明細(xì)胞狀態(tài)不好,會(huì)大幅降低病毒包裝效率。
3.使用高糖DMEM培養(yǎng)293T,低糖DMEM或者DMEM/F12等含糖量低的培養(yǎng)基可能影響293T細(xì)胞的生長狀態(tài)。
4.如果發(fā)生293T細(xì)胞不貼壁,漂浮在培養(yǎng)基中的現(xiàn)象,請(qǐng)確認(rèn)所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養(yǎng)箱中CO2濃度。并參考以下培養(yǎng)體系:
① DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成,使用5% CO2培養(yǎng)箱。
② DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成,使用10% CO2培養(yǎng)箱。
當(dāng)使用碳酸氫鈉含量高的培養(yǎng)基時(shí),必須將這些細(xì)胞在10% CO2中孵育,以便正確緩沖培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基沒有適當(dāng)緩沖時(shí),293T細(xì)胞雖然可以存活,但將無法粘附并保持漂浮在培養(yǎng)基中。
5.培養(yǎng)時(shí)可酌情使用預(yù)鋪0.2%明膠的培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿,若細(xì)胞狀態(tài)好,可省略此步驟。
6.本細(xì)胞僅用于科學(xué)研究,不得用于臨床治療。
7.請(qǐng)注意無菌操作,避免污染。
關(guān)鍵字: 293T,HEK-293T,人胚腎細(xì)胞;
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