磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說(shuō)明書
分光光度法50管/48樣
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒測(cè)定意義：
磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰膽堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，廣泛存在于高等動(dòng)植物和細(xì)菌等多種生物體中，具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。
測(cè)定原理：
磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋，無(wú)水乙醇。
試劑組成和配制：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體55mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加3mL無(wú)水乙醇充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：液體35mL×1瓶，4℃避光保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，4℃避光保存。
酶液提取：
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3. 血清：直接測(cè)定。
磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒測(cè)定操作：
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 |
試劑一（μL） | 100 |
|
|
試劑二（μL） | 150 | 150 | 150 |
標(biāo)準(zhǔn)品（μL） |
| 100 |
|
樣品（μL） |
|
| 100 |
試劑三（μL） | 50 | 50 | 50 |
充分混勻，30℃反應(yīng)30min，沸水浴10min，打開(kāi)蓋子，自然冷卻5min。 |
試劑四（μL） | 700 | 700 | 700 |
30℃反應(yīng)30min，于1mL玻璃比色皿，空白管調(diào)零，測(cè)定500nm處吸光值，分別記為A標(biāo)準(zhǔn)管和A測(cè)定管。 |
酶活計(jì)算公式：
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。
PLD活性（nmol/min/mg prot）= 
×C標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7 ×÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。
PLD活性（nmol/min/g 鮮重）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7×÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。
PLD活性（nmol/min/104 cell）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7×÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。
PLD活性（nmol/min/mL）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7×
C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min
注意事項(xiàng)：
1. 顯色完成后，若有沉淀，于8000g，25℃離心5min后取上清測(cè)定。
2. 吸光值不宜超過(guò)1，否則用試劑一將酶液進(jìn)行稀釋，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
關(guān)鍵字： 磷脂酶D（?Phospholipases;磷脂酶D（?Phospholipases;
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