丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase,PDC）活性測定試劑盒說明書

                                      分光光度法50管/48樣

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase,PDC）活性測定試劑盒測定意義：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測定原理：

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD⁺沒有；通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體36mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1支，﹣20℃保存。

試劑五：液體60μL×1支，﹣20℃保存。

混合試劑：臨用前配制，將試劑四和試劑五轉(zhuǎn)移至試劑三中充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑六：液體5mL×1瓶，4℃保存。

丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase,PDC）活性測定試劑盒粗酶液提?。?/span>

1、細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬細菌或細胞加入400μL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，工作3s，間歇10s，工作35次），16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2、組織處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）等液體樣品：直接檢測。

PDC測定操作：

1. 分光光度計預熱30min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃水浴中預熱30 min。

3. 空白管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL蒸餾水、100μL混合試劑、700μL試劑二和100μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2。

4. 測定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合試劑、700μL試劑二和100μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。

注意：空白管只需測定一次。

PDC活性計算公式：

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(Cpr×V樣) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (nmol/min /g鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (nmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞數(shù)量

（4）按血清（漿）體積計算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×10⁹}÷V樣÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V總：反應體系總體積，1mL=0.001 L，V樣：加入反應體系中上清液體積，0.1mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1 min。