中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）測定試劑盒說明書
分光光度法50管/24樣
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）測定試劑盒測定意義：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物產(chǎn)生，能催化水解木聚糖，也被稱為戊聚糖酶或半纖維素酶，可分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細(xì)胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進有效物質(zhì)的釋放，以及降低飼料中的非淀粉多糖，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，因而廣泛的應(yīng)用于釀造和飼料工業(yè)中，NEX一般分離自最適生長pH為6-8的微生物。
測定原理：
NEX在中性環(huán)境中催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進一步與3,5-二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應(yīng)，在540nm處有特征吸收峰，反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，通過測定反應(yīng)液在540nm吸光值增加速率，可計算NEX活力。
自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋，可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制：
緩沖液：液體65mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（若出現(xiàn)白色絮狀或顆粒狀沉淀，可60℃加熱溶解后使用）。
試劑二：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶提取：
1. 發(fā)酵液：發(fā)酵液于8000g，4℃，離心15min，取上清，作為待測樣品。
2. 酶干粉：稱約0.1mg，加1mL緩沖液溶解待測。
3. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL緩沖液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清待測。
中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）測定試劑盒測定操作表：
| 對照管 | 測定管 |
樣品（μL） | 200 | 200 |
緩沖液（μL） | 300 | 300 |
試劑一（μL） |
| 200 |
試劑二（μL） | 300 |
|
混勻，蓋緊瓶蓋，50℃水浴，反應(yīng)30min，立即沸水浴20min滅活。(注意不要讓蓋子爆開，以免進水，改變了反應(yīng)體系) |
試劑一（μL） | 200 |
|
試劑二（μL） |
| 300 |
混勻，沸水浴顯色5min(注意不要讓蓋子爆開，以免進水改變了反應(yīng)體系)，1mL玻璃比色皿，540nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。 |
NEX計算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.6904x + 0.0058，R2 = 0.9989
1. 按液體體積活力計算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/mL）= （ΔA-0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106
= 657× (ΔA-0.0058)
2. 按蛋白濃度計算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA -0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷Cpr
= 657×(ΔA -0.0058 ) ÷Cpr
3. 按鮮重計算：
酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。
NEX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA -0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數(shù)×106÷W
= 657×(ΔA -0.0058 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反應(yīng)時間，30min；稀釋倍數(shù)=V反總÷V樣=1000μL÷200μL=5；
106：轉(zhuǎn)化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
注意事項：
1. 吸光度變化應(yīng)該控制在0.01~0.8之間，否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變；也可以延長或者縮短反應(yīng)時間。
2. 試劑盒2-8℃保存，保質(zhì)期3個月，建議盡快使用。
關(guān)鍵字： 中性木聚糖酶（Neutral Xylan;中性木聚糖酶（Neutral Xylan;
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