葡萄糖含量試劑盒說明書（測組織、細(xì)菌或細(xì)胞）

                                  分光光度法50管/48樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動物而言，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織等的唯一能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。

測定原理：

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫；過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽和蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：0.5μmol/mL葡萄糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體 25ml×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體 25ml×1瓶，4℃保存；（若出現(xiàn)結(jié)冰現(xiàn)象，可37℃水浴溶解后使用）

葡萄糖提取：

1、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），研磨成勻漿，95℃水浴10分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。

2、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），95℃水浴10分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm，蒸餾水調(diào)零。

2、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合，用多少配多少。

3、加樣表（在EP管中加入下列試劑）：

混勻，置37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中，保溫15min，于505nm波長處讀取吸光度。空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光值分別記為A1、A2和A3?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

葡萄糖含量計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

葡萄糖含量(μmol/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)=0.5×(A3-A1)÷

(A2-A1)÷Cpr。

2、按樣本鮮重計(jì)算

葡萄糖含量（μmol/g 鮮重）= (C標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)=0.5×(A3-A1)÷

(A2-A1)÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

葡萄糖含量（μmol/ 10⁴ cell)= (C標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)=0.001×(A3-A1)÷

(A2-A1)

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V1：加入樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

注意：

1、最低檢測限為50nmol/g鮮重或0.5nmol/mg prot

2、若樣本中存在葡萄糖氧化酶抑制劑，則會造成測定結(jié)果偏低，建議改用HPLC法測定。