乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量測(cè)定試劑盒說明書
分光光度法10管/9樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量測(cè)定試劑盒測(cè)定意義：
乙酰輔酶A廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔酶A是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。
測(cè)定原理：
蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶A含量的高低。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1支，-20℃保存。臨用前加入100μL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：液體4μL×1支，4℃保存。臨用前加入100μL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入9mL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑五：液體10mL×1瓶，4℃保存。
工作液的配制：臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.92 m L），將試劑二、三和四按照1:1:90的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測(cè)定9樣）；加樣前置37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱30 min；現(xiàn)配現(xiàn)用；
乙酰輔酶A的提取：
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量測(cè)定試劑盒測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，用蒸餾水于340nm處調(diào)零。
2、取920μL工作液和100μL樣本至 1mL石英比色皿，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1和80s時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
乙酰輔酶A含量計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1640x + 0.012；x為吸光值，y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。
注意：本試劑盒最低檢測(cè)限為1.6nmol/mL。
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr
需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
乙酰輔酶A含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012) ÷W
(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
乙酰輔酶A含量(nmol/104)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
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上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學(xué)領(lǐng)域，提供科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)的生物企業(yè)。包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等 。旗下?lián)碛?“雅吉生物”、“晶風(fēng)生物”、“彩佑實(shí)業(yè)”、“GTX” 品牌。通過公司各部門員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶厚愛，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽(yù)”的精神，堅(jiān)持以優(yōu)良的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽(yù)為國內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。
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