還原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）試劑盒說(shuō)明書

                                                        分光光度法50管/48樣

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

GSH是細(xì)胞內(nèi)最主要的抗氧化巰基物質(zhì)，在抗氧化、蛋白質(zhì)巰基保護(hù)和氨基酸跨膜運(yùn)輸?shù)戎芯哂兄匾饔?。還原型與氧化型比值（GSH/GSSG）是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的主要?jiǎng)討B(tài)指標(biāo)。因此，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)。

還原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）試劑盒測(cè)定原理：

DTNB與GSH反應(yīng)生成復(fù)合物，在412nm處有特征吸收峰；其吸光度與GSH含量成正比。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

GSH測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中保溫30min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL蒸餾水，700μL試劑二，200μL試劑三，混勻靜置2min后測(cè)定412 nm吸光度A1。

4. 測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL上清液，700μL試劑二，200μL試劑三，混勻靜置2min后測(cè)定412 nm吸光度A2。

注意：空白管只需要測(cè)定一次。

GSH含量計(jì)算公式：

GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=1.5 x（x為GSH濃度，μ mol /mL；y為吸光值）

GSH計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷（V樣×Cpr ）=0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

GSH（μ mol/g鮮重）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSH（μ mol /10⁴ cell）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)=0.667×(A2－A1) ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷V樣 =0.667×(A2－A1)

V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；

還原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）試劑盒注意事項(xiàng)：

1. 試劑一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。

2. 最低檢出限為0.01mmol/L。