注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
硝態(tài)氮是植物最主要的氮源。植物體內(nèi)硝態(tài)氮含量反映了土壤中硝態(tài)氮的供應情況，可作為土壤氮肥的指標。測定植物體內(nèi)的硝態(tài)氮含量，不僅能夠反映出植物的氮素營養(yǎng)情況，而且對鑒定蔬菜和以植物為原料的加工制品的品質也有重要的意義。
植物硝態(tài)氮試劑盒測定原理：
在濃酸條件下，NO3-與水楊酸反應，生成硝基水楊酸，硝基水楊酸在堿性條件下（PH>12）呈黃色，在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與含量成正比，可比色測定計算得硝態(tài)氮含量。
自備實驗用品及儀器：
蒸餾水、天平、常溫離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×2瓶，4℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加2mL濃硫酸充分溶解。
試劑二：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1支，4℃保存。
樣本處理：
按照質量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL蒸餾水）加入蒸餾水，室溫勻漿后置于90℃恒溫水浴鍋中浸提30min，期間不斷晃動或者置于90℃恒溫搖床中振蕩提取30min，待冷卻后于25℃，12000g離心15min，取上清待測。（深色植物勻漿后加入約3mg試劑三后再提取）
植物硝態(tài)氮試劑盒測定操作表：
| 空白管 | 測定管 |
樣本（μL） |
| 30 |
蒸餾水（μL） | 30 |
|
試劑一（μL） | 60 | 60 |
充分混勻，25℃靜置30min |
試劑二（μL） | 1425 | 1425 |
混勻，渦旋振蕩，使出現(xiàn)的沉淀充分溶解，取1mL于1mL玻璃比色皿中測定410nm處吸光值A，△A=A測定管-A空白管 |
注意：空白管只需測定一次。
計算公式：
標準曲線：y=0.0156x+0.0073，R2=0.9997
NO3—— N含量（mg/kg鮮重）=（△A-0.0073）÷ 0.0156÷（W÷V樣總）
=64.1×（△A-0.0073）÷W
V樣總：加入提取液體積，1mL，W：樣本質量，g
注意事項：
1. 試劑一配制好后盡快使用，4℃可保存一周。
2. 試劑一和試劑二均具有強腐蝕性，操作時需做好防護措施。
3. 最低檢出限為2μg/g。
一．試劑配制
1、標準溶液
鹽酸標準溶液[c (HCl)=0.1000 mol/L]，移取9 mL 濃鹽酸（鹽酸濃度36%～38%）用蒸餾水稀釋并定容至1000 mL容量瓶，搖勻，用無水碳酸鈉進行標定。
無水碳酸鈉標定方法：取50mL蒸餾水，加入10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑，用配置好的鹽酸溶液滴定至溶液由變?yōu)榘导t色，消耗鹽酸體積記為V0；再準確稱取經(jīng)300℃烘干1小時的無水碳酸鈉0.2g，精確至0.0001，記為m，溶于少量蒸餾水中定容至50mL，加入10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑，用配置好的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸3分鐘，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液呈暗紅色，消耗鹽酸體積記為V。
C（HCl）=m/[(V-V0)*0.05299],其中C（HCl）單位為mol/L。
2、40%氫氧化鈉溶液1000 ml（400 g/L）
400g氫氧化鈉溶解于1000mL無氨蒸餾水中；
3、2%濃度硼酸溶液2000 ml （20g/L）
分析純硼酸40g溶于2000ml無氨蒸餾水中；
4、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑
A：稱取0.1g 甲基紅，用無水乙醇定容至100 ml；
B：稱取0.1g 溴甲酚綠，用無水乙醇定容至100 ml.
臨用時按照A:B=1:5混勻。取10ml加入1000ml硼酸溶液中。
5、高錳酸鉀溶液：2.5g高錳酸鉀溶于50mL蒸餾水中。
6、1:1硫酸溶液：100mL濃硫酸緩慢加入100ml蒸餾水中，邊加邊攪拌。
二．樣品消解
1. 將植物樣本粉碎，80℃烘干至恒重，過40目篩，稱取約0.3g，加入消化管中，同時取空消化管兩支，用移液管分別往每管中加入10mL濃硫酸，輕輕晃動消化管。
2. 將20支消化管全部置于石墨消解儀上，蓋好蓋子，打開廢氣回收系統(tǒng)以及石墨消解儀，溫度設置為：曲線加熱100℃，10min；280℃，10min；400℃，40min。
3. 取出消化管冷卻至室溫，切勿在樣品冷卻之前開蓋。每支消化管中緩慢加入1mL過氧化氫，搖勻，重新
放置在石墨消解儀上，溫度設置為：曲線加熱200℃，10min；320℃，30min；400℃，30min。
4. 取出消化管冷卻至室溫，切勿在樣品冷卻之前開蓋。每支消化管中緩慢加入0.5mL過氧化氫，搖勻，重新放置在石墨消解儀上，溫度設置為：曲線加熱200℃，10min；320℃，30min；400℃，60min。若樣本未呈現(xiàn)澄清狀態(tài)，應繼續(xù)加熱至澄清，即消解完全。
5. 關閉石墨消解儀，待樣品冷卻后關掉廢氣回收系統(tǒng)。
三．全氮測定
1. 將滴定酸桶，硼酸桶，堿桶，蒸餾水桶管路按照標示插好（滴定酸桶的管子應插到底部），將硼酸桶，堿桶，蒸餾水桶的液位檢測插好。
2. 打開定氮儀與循環(huán)水系統(tǒng)，進入清洗界面，先進行兩次硼酸清洗管路，再進行一次換酸清洗，一次堿管路清洗。
3. 裝一只空的消化管，關好防護門。點擊【測試】菜單系統(tǒng)自動進入操作模式界面，選擇【自動測試】，常規(guī)，設置參數(shù)為：樣品編號；樣品重量：0.000g。滴定酸濃度：標定好的鹽酸濃度(mol/L)；空白值：0.000mL；蛋白系數(shù)：樣品固定的轉換系數(shù)。硼酸：15ml；稀釋水：20mL；堿液：0mL；蒸餾：5min；設置完成后，點擊【確定】即可進入自動測試功能。
4. 測試完成后打印測定結果。
5. 打開安全門，戴棉質手套取出消化管，放入樣品空白管，關好防護門。點擊【測試】菜單系統(tǒng)自動進入操作模式界面，選擇【自動測試】，常規(guī)，堿液參數(shù)設置為40mL，其余參數(shù)同步驟3，重復步驟3。
6. 樣品測定：設置參數(shù)為：樣品編號；樣品重量：稱取的樣品實際質量，g。滴定酸濃度：標定好的鹽酸濃度(mol/L)；空白值：兩支空白管滴定用酸量的平均值，mL；蛋白系數(shù)：樣品固定的轉換系數(shù)。硼酸：15ml；稀釋水：20mL；堿液：40mL；蒸餾：5min；設置完成后，點擊【確定】即可進入自動測試功能。
7. 測試完成后打印測定結果。
8. 進行儀器清洗，然后關閉循環(huán)水系統(tǒng)及定氮儀，然后清潔儀器。
四．注意事項
1. 禁止使用邊緣有缺口，或者有裂縫的消化管進行消解，消解時蓋子放置好，以免廢氣泄露，消解儀工作狀態(tài)盡量不要靠近儀器，但是要經(jīng)常觀察管內(nèi)變化，若出現(xiàn)異常情況，立即斷電。
2. 開始蒸餾時，消化管中液體的總體積以不超過總體積的1/3。
3. 拿取消化管時，注意高溫燙傷。放置消化管時，左右旋轉幾下，確保消化管與蒸餾頭密封。
4. 每日做完實驗要用洗瓶沖洗蒸餾頭殘余堿液，儀器前部的槽皿中，如果積有液體，請擦洗干凈。
5. 為了延長防濺裝置的使用壽命，請每天工作結束后清洗兩次左右：即消化管加水150mL空蒸5分鐘。（空蒸儀器把加堿量設置為“0”）。
6. 關機前，需將接收杯內(nèi)液體排凈，儀器使用結束后要關閉水源、電源，儀器上要放置一空消化管（防止防濺裝置內(nèi)殘留液體流到儀器上）。
7. 做完實驗將消解管清洗干凈（包括壁內(nèi)和壁外），然后放烘箱烘干，烘干后若長時不用則收起來。消解儀各部位上若有硫酸殘留需及時擦拭干凈一面被腐蝕，消解儀蓋子以及托盤需長清洗保持潔凈。
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