產(chǎn)品及特點(diǎn) 研究真核基因的最基礎(chǔ)的工作之一就是確定其轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，目前最通用的方法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman發(fā)明的、通過 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技術(shù)，它在不建立 cDNA 文庫的前提下，利用已知 cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，通過往兩端延伸和擴(kuò)增獲得其 3′-端序列。本試劑盒就是根據(jù) 3′-RACE 原理而開發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，客戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備各種材料。
2. 反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，包括使用無 RNase H 活性的 MMLV 和優(yōu)化的引物。
3′-RACE 的原理如下圖：
規(guī)格及成分 成 分 編 號 小扁盒包裝
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合物 101104a 10 μL(紅蓋)
RT Buffer（含 dNTP） 60906 50 μL(白蓋)
PCR MagicMix 3.0 90805 1 mL*2(紅蓋)
3′-RACE 引物 A（10 μM） yw373 10 μL(藍(lán)蓋)
3′-RACE 引物 B（10 μM） yw374 100 μL(綠蓋)
3′-RACE 引物 C（10 μM） yw375 100 μL(本色蓋)
RNase-Free 水 80403 1 mL(亮黃蓋)
使用手冊 101104sc 1 份
自備試劑 Poly(A) RNA（或總 RNA）、基因?qū)Ｒ恍砸?A、基因?qū)Ｒ恍砸?B、超純水。
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存、有效期一年。
使用方法 一：引物的設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作
利用已道序列的區(qū)域設(shè)計(jì)基因?qū)Ｒ恍砸锶龡l（A、B），其中引物 B 和 A 引物比較，靠 3’端 10-30 個堿基，類似巢式 PCR 的引物設(shè)計(jì)。自備的基因?qū)Ｒ恍砸锏?Tm 跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，即 Tm 為 58℃。引物合成后加超純水使其濃度為 10 μM，放冰上待用。
二：利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
3’RACE試劑盒注意：MMLV 酶使用前必須短暫離心，因?yàn)樗?50%甘油，及其粘稠，否則將取不到所需體積。
1. 在一個 PCR 管中，加入以下組分：
成分 用量
Poly(A) RNA（或總RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）
3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL
MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL
RNase-Free水 補(bǔ)至19 μL
合計(jì) 19 μL
注意：如果可能，使用Poly(A) RNA作為模板。
2. 65℃保溫 5 分鐘, 展開 RNA 的二級結(jié)構(gòu)，立即冰浴待用。
3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合物。
4. 先 37℃保溫 60 分鐘，再 42℃保溫 30 分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后 50℃保溫
10 分鐘終止反應(yīng)。
5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀釋上步得到的 cDNA，冰浴待用。長期放置需要
放-20℃保存。
三：利用基因?qū)Ｒ恍砸?A 和 3′ RACE 引物 B 進(jìn)行輪 PCR
6. 用不同量的 RT 反應(yīng)液（即稀釋后的 cDNA 模板）設(shè)置 PCR，樣品組需要設(shè)置
模板用量梯度，單位：μL。
成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4
稀釋后的 cDNA 1 5 10 15
基因?qū)Ｒ恍砸?A（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5
3′ RACE 引物 B（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5
98℃ 5 分變性 RNA-cDNA 雜交鏈，短暫離心后再加入下列成分
PCR MagicMix 3.0 25 25 25 25
RNase-free 水 19 15 10 5
合計(jì) 50 50 50 50
7. 按下列參數(shù)進(jìn)行 cDNA 第二鏈的合成和 PCR：
第 1 步，cDNA 第二鏈的合成：52-60℃ 2分鐘，72℃ 40 分鐘（此步的目
地是合成第二鏈的 cDNA，復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?A 的 Tm
值決定，一般可以從 55℃開始）。
第二步 PCR 循環(huán)：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分鐘，72℃ 3分鐘，循環(huán)數(shù)
30。（此步為 PCR 擴(kuò)增，復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?A 的 Tm
值決定，一般可以從 55℃開始）。
最后延伸：72℃ 15 分鐘。
8. 取 5 μL PCR 反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。若得到目的
擴(kuò)增產(chǎn)物需要用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，請于-20℃保存；若沒有得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，可
按下列步驟進(jìn)行巢式 PCR 反應(yīng)。
四：利用基因?qū)Ｒ恍砸?B 和 3′ RACE 引物 C 進(jìn)行巢式 PCR 反應(yīng)
9. 將上輪 PCR 產(chǎn)物（4 管）用水稀釋約 20 倍（在 50μL PCR 反應(yīng)液中加入 1mL
超純水），然后分別作為模板進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)設(shè)置如下：
成分 1-4管
PCR MagicMix 3.0 各 25 μL
上步得到的PCR反應(yīng)液（稀釋20倍后） 4 種之一 1 μL
基因?qū)Ｒ恍砸?B（10 μM） 2.5 μL
3′ RACE 引物 C（10 μM） 2.5 μL
超純水 補(bǔ)至 50 μL
10. PCR 反應(yīng)。按下列條件進(jìn)行 PCR：
第 1-30 次循環(huán)：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分鐘，72℃ 3分鐘（復(fù)性溫度需
要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?B 的 Tm 值進(jìn)行優(yōu)化，一般可以從 55℃開始）。
最后延伸：72℃ 15 分鐘。
11. 電泳檢測。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行 DNA 測序或 TA 克隆
關(guān)鍵字： 3’RACE試劑盒;
上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學(xué)領(lǐng)域，提供科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)的生物企業(yè)。包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等 。旗下?lián)碛?“雅吉生物”、“晶風(fēng)生物”、“彩佑實(shí)業(yè)”、“GTX” 品牌。通過公司各部門員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶厚愛，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽(yù)”的精神，堅(jiān)持以優(yōu)良的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽(yù)為國內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。
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本公司鄭重承諾：質(zhì)量保證、供貨及時、服務(wù)周到。