HiPSC人源性神經(jīng)干原代細(xì)胞培養(yǎng)操作

取新生1天的SD大鼠，在無(wú)菌條件下用眼科剪剪除背部皮膚，剪去全部脊椎，將脊椎腹側(cè)朝下置于滅菌毛玻璃片上。在解剖顯微鏡下，沿椎管兩側(cè)水平剪除背側(cè)一半椎骨，暴露脊髓和神經(jīng)節(jié)。用微解剖鑷剝離脊髓后，從椎間孔中挑出背根神經(jīng)節(jié)，置于盛有預(yù)冷PBS液的滅菌玻璃平皿中，剝除神經(jīng)節(jié)被膜后，用1ml移液器將神經(jīng)節(jié)移入15ml離心管中，PBS離心漂洗2次。離心管中加入4ml 0.125%胰蛋白酶，吹打、混懸神經(jīng)節(jié)，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20min，加入4ml DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，離心漂洗2次后，再加入2ml Neurobasal培養(yǎng)基(含4.5g/L D-葡萄糖，2mmol/L L-谷氨酰胺、1%FBS、20ml/L B-27添加劑、10ug/ml NGF、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)。移液器反復(fù)吹打20-30次，使背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞盡可能分散，經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先涂有PLL的細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為2-3x105/ml細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中靜置培養(yǎng)，每周換液2次。

細(xì)胞動(dòng)物及主要試劑

SD大鼠(新生1d)，購(gòu)自武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；

NGF購(gòu)自PeproTech公司；

Neurobasal培養(yǎng)基、DMEM、胎牛血清(FBS)、B-27添加劑(50X)購(gòu)自Gibeo公司；

L-谷氨酰胺、多聚賴氨酸(PLL)胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；

胰蛋白酶購(gòu)自AMRESCO公司；

雙抗（青、鏈霉素）購(gòu)自HyClone公司

HiPSC人源性神經(jīng)干原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作

1、 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，鋪滿瓶底80%左右或有細(xì)胞堆疊生長(zhǎng)時(shí)即可傳代；

2、棄去原瓶培養(yǎng)液，用PBS清洗1~2次，加入3~4ml新鮮培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮沿一個(gè)方向依次將瓶底細(xì)胞刮下，不要反復(fù)來(lái)回刮，對(duì)細(xì)胞損傷較大。刮完后可在鏡下觀察，若細(xì)胞團(tuán)較多可用吸管輕輕吹散。也可直接用吸管吹打收集細(xì)胞，一般會(huì)有部分細(xì)胞吹不下來(lái)，可收集吹下來(lái)的部分細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，切忌吹打過(guò)度。

3、將收集到的細(xì)胞按一定比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，一般3~4h內(nèi)大部分細(xì)胞都會(huì)貼壁，若細(xì)胞碎片較多可在細(xì)胞貼壁后換液除去。

1. 確保所有實(shí)驗(yàn)室材料都無(wú)菌

交叉污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。即使是最輕微的污染，也可能毀了幾個(gè)星期的成果。因培養(yǎng)箱內(nèi)溫暖潮濕，真菌極易生長(zhǎng)，因此必須注意定期清潔。此外，在將 培養(yǎng)瓶、移液管及其他的相關(guān)物品放入超凈臺(tái)之前，應(yīng)用酒精擦拭干凈，以避免污染。

2. 小心處理您的培養(yǎng)物

細(xì)胞培養(yǎng)的脆弱性怎么強(qiáng)調(diào)也不為過(guò)。 劇烈搖晃，或連續(xù)的溫度波動(dòng)可能會(huì)對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響。確保培養(yǎng)箱是水平的，溫度均一，且遠(yuǎn)離電動(dòng)儀器。此外， 盡量避免一次處理多個(gè)細(xì)胞系，因?yàn)樗赡軙?huì)影響細(xì)胞的基因型和表型。您還應(yīng)定期完成STR圖譜分析，以確認(rèn)細(xì)胞系的身份。

3. 在使用前正確解凍細(xì)胞

盡管解凍看起來(lái)是個(gè)簡(jiǎn)單的步驟，但必須操作得當(dāng)，以免傷害細(xì)胞。長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫條件下會(huì)使細(xì)胞無(wú)法鋪板。因此，凍存管應(yīng)當(dāng)在37°C水浴中放置2分鐘，然后用條件培養(yǎng)基稀釋，以避免DMSO造成直接傷害。

4. 使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程共有3個(gè)階段：停滯期、 對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期，分別代表了低細(xì)胞生長(zhǎng)、高細(xì)胞生長(zhǎng)和無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)。最有活力的細(xì)胞是健康的，快速分裂的，在對(duì)數(shù)期以70-80%的匯合度存在。

5. 在傳代之前不要讓細(xì)胞完全匯合

匯合度是指貼壁細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)瓶表面積的比例。完全匯合意味著100%的表面都被貼壁細(xì)胞覆蓋。一定要避免這種狀態(tài)，因?yàn)樗馕吨?xì)胞不能繼續(xù)生長(zhǎng)。不過(guò)，當(dāng)務(wù)之急是使用活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞。

6. 選擇的培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)策略

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基是控制產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量和成本的最重要因素。必須針對(duì)每種培養(yǎng)物來(lái)定制培養(yǎng)基，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在決定以哪種方式來(lái)開(kāi)發(fā)您的培養(yǎng)基時(shí)，您有幾個(gè)選擇。您可以購(gòu)買(mǎi)現(xiàn)成的，自己開(kāi)發(fā)，也可以與另一家公司合作開(kāi)發(fā)特定的培養(yǎng)基。在這個(gè)過(guò)程中，您需要考慮時(shí)間和成本等因素。

7. 配制干粉培養(yǎng)基時(shí)評(píng)估水的質(zhì)量

液體培養(yǎng)基往往會(huì)帶來(lái)比干粉培養(yǎng)基更高質(zhì)量的結(jié)果。這可能與水的質(zhì)量有關(guān)。由于細(xì)菌在水中迅速生長(zhǎng)，故需要監(jiān)控內(nèi)毒素及其他污染物。專業(yè)公司有資源來(lái)控制細(xì)菌生長(zhǎng)，比如過(guò)濾器。因此使用專業(yè)化生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基會(huì)更加可靠一點(diǎn)。

8. 利用細(xì)胞的代謝特性來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基

分析使用過(guò)的培養(yǎng)基，有助于鑒定必要成分的代謝速率，包括氨基酸和維生素。從細(xì)胞生長(zhǎng)階段和蛋白生產(chǎn)階段收集到的動(dòng)態(tài)代謝圖譜可用來(lái)平衡基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加培養(yǎng)基，指導(dǎo)培養(yǎng)基的重點(diǎn)。

9. 避免細(xì)胞的過(guò)度消化

胰蛋白酶通過(guò)消化負(fù)責(zé)讓細(xì)胞與容器結(jié)合的蛋白質(zhì)，而實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的傳代。如果細(xì)胞暴露在胰酶中時(shí)間太長(zhǎng)，則胰酶將開(kāi)始切割細(xì)胞表面蛋白，這會(huì)影響細(xì)胞行駛正常功能的能力。

10. 培養(yǎng)基中不要一直使用抗生素

隨著細(xì)胞培養(yǎng)物更加頻繁地暴露在抗生素中，對(duì)抗生素有著天然耐藥性的菌株將開(kāi)始出現(xiàn)。這種現(xiàn)象可掩蓋潛在的污染，這對(duì)實(shí)驗(yàn)是非常有害的。

HiPSC人源性神經(jīng)干原代細(xì)胞注意事項(xiàng)

1、 培養(yǎng)過(guò)程中要盡量減少熱源的接觸，建議用一次性使用的瓶皿培養(yǎng)，一切與細(xì)胞接觸的器具要進(jìn)行去熱源處理，建議使用進(jìn)口血清；

2、傳代時(shí)吹打不宜過(guò)度，吹下來(lái)的細(xì)胞足夠傳代即可，不要反復(fù)吹打；

3、細(xì)胞生長(zhǎng)速度很快，一般1~2天要傳一次代，密度達(dá)到80%左右即可傳代，可以適當(dāng)降低接種密度，但密度較低時(shí)細(xì)胞會(huì)成堆生長(zhǎng)，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞堆疊生長(zhǎng)時(shí)也應(yīng)當(dāng)傳代；

4、若沒(méi)時(shí)間處理細(xì)胞，為避免細(xì)胞長(zhǎng)過(guò)，可適當(dāng)降低血清濃度（不低于5%）以減緩細(xì)胞生長(zhǎng)速度，但不宜長(zhǎng)期低血清培養(yǎng)，一般需正常培養(yǎng)1~2代以恢復(fù)其狀態(tài)。