作為生命活動的主要承擔者,蛋白質(zhì)的功能一直是科研活動中備受關注的明星。蛋白質(zhì)通常不是“單打獨斗”的,絕大多數(shù)的功能蛋白質(zhì)會與其他蛋白質(zhì)相互作用,一起調(diào)控生命過程。那么,研究蛋白質(zhì)互作的技術,你了解多少呢?
No.1
免疫共沉淀
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,COIP)技術是利用抗原抗體之間具有特異的免疫結合的原理,在細胞裂解液中加入特異性抗體,將抗原及與抗原結合的蛋白沉淀下來。免疫復合物可以通過Western Blot的方法驗證抗原和其他蛋白之間的相互作用,也可以用質(zhì)譜的方法,檢測抗原的結合蛋白成員。
OIP技術的優(yōu)缺點
優(yōu)點:
(1)得到的互作蛋白是細胞內(nèi)與誘餌蛋白天然互作的,符合體內(nèi)真實生理情況;
(2)實驗條件溫和,可避免人為的影響;
(3)可分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。
缺點:不適用于結合力弱或者瞬間結合的蛋白互作研究。
No.2
Pull Down
Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系,從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。COIP檢測到的蛋白互作關系可能是第三個蛋白作為橋梁建立的,與之相比,pull down技術可用于檢測蛋白之間的直接互作關系。但pull down需要先把誘餌蛋白原核表達純化出來,再與目的蛋白溶液孵育,其無法像COIP一樣模擬細胞內(nèi)天然的互作環(huán)境。
No.3
雙分子熒光互補
雙分子熒光互補技術是指熒光蛋白多肽鏈在某些不保守的氨基酸處切開,形成不發(fā)熒光的N-和C-末端2個多肽片段。將這2個熒光蛋白片段分別連接到1對能發(fā)生相互作用的目標蛋白上,在細胞內(nèi)共表達或體外混合這2個融合蛋白時,由于目標蛋白質(zhì)的相互作用,熒光蛋白的2個片段在空間上互相靠近互補,重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子,從而產(chǎn)生熒光??梢暬?BiFC 技術的特點。
No.4
酵母雙雜交
酵母雙雜交系統(tǒng)是當前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后,誘餌蛋白結合于報道基因的啟動子,啟動報道基因在酵母細胞內(nèi)的表達,如果檢測到報道基因的表達產(chǎn)物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用。在實際工作中,人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。
關鍵字: 蛋白質(zhì)純化;免疫沉淀;
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