線粒體提取試劑盒
一、產(chǎn)品簡介。
線粒體是細胞內(nèi)的雙層膜系結構，含有少量 DNA 和大量能量代謝相關酶類，是細胞內(nèi)的動力工廠，參與細胞內(nèi)多種生物學效應。
本產(chǎn)品能夠快速且完整的提取細胞內(nèi)的線粒體，保持線粒體膜的完整性和線粒體內(nèi)各種蛋白酶類的活性，用于后續(xù)的線粒體膜電位測定、酶活性檢測，蛋白表達水平檢測和亞細胞定位分析，也可用于線粒體 DNA 的提取等實驗。
二、運輸與存儲條件。
本產(chǎn)品常溫運輸，4 ℃保存，有效期 12 個月。
三、特點與優(yōu)勢。
1. 本產(chǎn)品與 Thermo 公司的產(chǎn)品（89874）品質(zhì)類似，可以快速分離提取線粒體。
2. 本產(chǎn)品提取的線粒體完整性好，產(chǎn)量大。
四、自備試劑與耗材。
PBS、RIPA 裂解液（不含 SDS）、2.0 ml 離心管、震蕩混勻儀（Vortex mixer）、冷凍離心機。
五、使用說明。
1. 細胞收集。胰酶消化法收集貼壁細胞，或離心法直接收集懸浮細胞，每個樣品含 2×107 細胞。
2. 低滲處理。加入 800 μl Reagent MA 試劑，震蕩（Vortex）5 sec，重懸細胞。冰上孵育 2 min。（盡量不要超過 2 min，以免影響后續(xù)實驗）
3. 細胞裂解。加入 10 μl Reagent MB，劇烈震蕩（vortex at the maximum speed）5 sec，冰上孵育 5 min，每分鐘劇烈震蕩 1 次 （vortex，5 sec）。
4. 終止裂解。加入 800 μl Reagent MC，顛倒混勻幾次，此步驟不要震蕩混勻（No Vortex）。
5. 離心。700×g，4 ℃離心 10 min，棄沉淀（粗細胞核），上清轉移到新的離心管中。。
6. 3,000×g，4 ℃離心 15 min，上清為細胞漿，沉淀為線粒體。細胞漿轉移到新的離心管，可凍存。（若需提高線粒體產(chǎn)量，離心條件改為 12,000×g，4 ℃離心 30 min，可以加線粒體產(chǎn)量，但也會增加溶酶體和過氧化物酶體污染）
7. 洗滌線粒體。線粒體沉淀中加入 500 μl Reagent MC，輕輕震蕩混勻，12,000×g，4 ℃離心 5 min，棄上清，沉淀即為純化的線粒體。
8. 純化的線粒體可立即用于測定膜電位，也可凍存在-80 ℃冰箱中。
9. 線粒體裂解。包括以下三種方式。
1) 變性裂解液裂解。利用本公司的細胞裂解液（Laemmli Buffer，2×，Cat：Omp-01）重懸線粒體沉淀，裂解線粒體，提取線粒體蛋白，用于后續(xù)的 western blot 分析。但提取蛋白已經(jīng)變性，不可用于酶活性測定。
2) RIPA 裂解液裂解。利用溫和的 RIPA 裂解液（不含 SDS）重懸線粒體沉淀，裂解線粒體，提取蛋白可以用于酶活性測定及 western blot 等實驗。
3) 反復凍融法裂解。用 PBS 重懸線粒體，在-80 ℃冰箱或液氮中急速凍結線粒體溶液，37℃水浴鍋中快速融化線粒體溶液，重復 3 次，完成線粒體裂解，提取蛋白可用于線粒體酶活性檢測、western blot 等實驗。
六、注意事項
1. 請用新提取的線粒體來測定膜電位，凍存后的線粒體，其膜的完整性受到破壞，不宜用于測定膜電位。
2. 整個實驗需在低溫條件下進行，所用試劑提前預冷。
3. 分離的細胞漿可以12,000×g，4 ℃離心15 min，棄沉淀，上清轉移至新的離心管，即為純化后的細胞漿。細胞漿純化后可以減少溶酶體和過氧化物酶體的污染。
4. 細胞漿溶液中含有EGTA，不宜用BCA法測定蛋白濃度，請用Bradford法測定蛋白濃度。
5. 為了抑制蛋白降解，實驗過程中可添加蛋白酶抑制劑（如cocktail等）。
關鍵字： 線粒體提取試劑盒;高純線粒體分離;
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