體外研究活性 |
PF-04929113是小分子Hsp90抑制劑。PF-04929113轉(zhuǎn)化為SNX-2122起作用, SNX-2122是 Hsp90抑制劑的活性形式。PF-04929113有效作用于Her-2 穩(wěn)定性,也引起Hsp70上調(diào)。PF-04929113作用于一系列癌細(xì)胞類型,具有有效的抗增殖活性。MCF-7(IC50=16 nM), SW620(IC50=19 nM), K562(IC50=23 nM), SK-MEL-5(IC50=25 nM), 及 A375(IC50=51 nM)。[1] |
激酶實(shí)驗(yàn) |
Hsp90親和力測試 |
豬脾臟提取的Hsp90從嘌呤親和培養(yǎng)基中分離。使用指定濃度PF-04929113(0.8 到 500 μM)處理Hsp90上樣培養(yǎng)基 ,然后通過 Bradford 蛋白檢測測定每種濃度下釋放的Hsp90量。結(jié)果獲得的IC50糾正為ATP配體濃度,作為表觀Kd值。 |
細(xì)胞實(shí)驗(yàn) |
細(xì)胞系 |
MCF-7, SW620, K562, SK-MEL-5 和A375 癌細(xì)胞 |
濃度 |
0–300 nM |
孵育時(shí)間 |
72 或 144 小時(shí) |
方法 |
所有實(shí)驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行。細(xì)胞接種到96孔板中,隨后加入PF-04929113處理24小時(shí),測定增殖率,然后根據(jù)細(xì)胞生長率細(xì)胞再生長72小時(shí)或144小時(shí)。收獲時(shí),移除培養(yǎng)基,使用CyQuant DNA 染料測定每孔中DNA含量。使用PF-04929113處理24小時(shí),再通過甲醇固定后,使用 ArrayScan 4.5 儀器進(jìn)行高含量分析(HCA),測量A375中Hsp90 服務(wù)蛋白和磷酸化蛋白水平。在4%PBS緩沖福爾馬林溶液中固定后,再使用0.1% TX-100進(jìn)行滲透,最后使用抗-Her2,抗磷酸化-S6(pS6), 抗-pERK, 及抗-Hsp70一抗,然后是TRITC 或 FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行探針標(biāo)記。使用Hoechst DNA結(jié)合染料進(jìn)行核染色。 根據(jù)每孔中每組細(xì)胞服務(wù)蛋白和磷酸化蛋白的平均染色強(qiáng)度確定250-500個(gè)核。然后計(jì)算每孔中平均服務(wù)蛋白染色強(qiáng)度。 |
實(shí)驗(yàn)圖片 |
檢測方法 |
檢測指標(biāo) |
實(shí)驗(yàn)圖片 |
PMID |
Western blot |
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