背景^[1-7]

EMSA試劑盒是用于EMSA(也稱gel shift)研究的一個(gè)試劑盒。通過EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的結(jié)合情況，從而可以研究細(xì)胞內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄因子的激活水平。本試劑盒提供了進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)的探針標(biāo)記、蛋白和DNA結(jié)合以及EMSA上樣等的主要試劑，使EMSA實(shí)驗(yàn)變得簡(jiǎn)單方便。EMSA結(jié)合緩沖液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的濃度經(jīng)過優(yōu)化，可以很好的消除蛋白和標(biāo)記探針間的非特異性結(jié)合，同時(shí)又不會(huì)減弱目的轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記探針間的結(jié)合。

電泳遷移率變動(dòng)分析（electrophoretic mobility shift assays，EMSA），又叫凝膠阻滯電泳，是近年發(fā)展起來的研究核酸與蛋白質(zhì)相互作用的簡(jiǎn)單、快速、敏感的方法，目前已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。其基本原理是核酸與蛋白質(zhì)發(fā)生作用時(shí)會(huì)形成核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物在凝膠中比未結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸泳動(dòng)速度慢，即形成一條相對(duì)滯后的條帶。

該方法可用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白，并可通過加入特異性的抗體來檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)。PIERCE將其卓越的SuperSignal®化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)和DNA末端生物素標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)的EMSA，利用HRP標(biāo)記的鏈親和素與標(biāo)記在DNA上的生物素之間的超強(qiáng)結(jié)合，使HRP固定在DNA上并催化發(fā)光底物反應(yīng)發(fā)光，再通過X光片或冷光CCD檢測(cè)。

EMSA原理：

EMSA一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

EMSA通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。

在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。

特點(diǎn)：

1.安全環(huán)保：采用非同位素的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，免除放射性的危險(xiǎn)與處理同位素廢物的麻煩，減少環(huán)境污染；無須專門的同位素操作室，易于使用推廣。

2.高靈敏度：PIERCE的SuperSignal®Dura底物使檢測(cè)靈敏度達(dá)到10-14克，等同于或者超過同位素標(biāo)記系統(tǒng)。

3.快速省時(shí)：從標(biāo)記探針到結(jié)果分析，全部實(shí)驗(yàn)只需5小時(shí)。

4.穩(wěn)定可靠：DNA末端標(biāo)記生物素，不影響蛋白結(jié)合位點(diǎn)。標(biāo)記好的DNA可以保存一年。

5.配備完整：該試劑盒包括EBNA對(duì)照系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)等所有試劑，需要自備的只有生物素末端標(biāo)記的DNA、蛋白質(zhì)樣品、尼龍膜和電泳設(shè)備。

應(yīng)用^[8]

EMSA試劑盒可用于轉(zhuǎn)錄克隆蛋白的檢測(cè)：

通過PCR擴(kuò)增的方法從大豆品種Harosoy中克隆到1個(gè)新的b ZIP基因(Gmb ZIP71),基因表達(dá)分析表明Gmb ZIP71在葉片、生長(zhǎng)點(diǎn)、花、花芽、莢和根等多個(gè)器官中表達(dá)。將Gmb ZIP71構(gòu)建到原核表達(dá)載體p ET29b上,導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中,對(duì)其進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。結(jié)果表明:在IPTG濃度為0.25 mmol·L-1,誘導(dǎo)時(shí)間為4 h,誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí),重組蛋白得到表達(dá),分子量大約為48 k Da,SDS-PAGE電泳結(jié)果表明重組蛋白主要以包涵體形式存在,用His蛋白純化系統(tǒng)回收得到Gmb ZIP71-His重組蛋白,EMSA(electrophoretic mobility shift assay)

參考文獻(xiàn)

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