背景[1-6]
RNA pulldown試劑盒是利用T4 RNA連接酶將單個(gè)脫硫生物素化的胞苷二磷酸連接到單鏈RNA的3’端。3’端的末端標(biāo)記不干擾RNA結(jié)構(gòu)，因此，該生物素標(biāo)記不會(huì)影響RNA與蛋白的互相作用。每一次反應(yīng)需要50pmol RNA。孵育時(shí)間的延長，以及在標(biāo)記反應(yīng)中加入DMSO，可優(yōu)化RNA的標(biāo)記效率。RRNA結(jié)合蛋白(RBPs)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)起著重要的作用，具體的作用包括mRNA前體的剪接、多腺苷化和穩(wěn)定性的維持，mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸，mRNA的定位和翻譯等。
RBPs在這些過程中的調(diào)節(jié)作用是通過結(jié)合新合成的或者成熟后的轉(zhuǎn)錄物的特定序列實(shí)現(xiàn)的。于此同時(shí)，有很多RBPs能夠識(shí)別RNA中的特定核苷酸序列。為了研究RNA與蛋白的相互作用建立了很多方法，這些方法包括EMSA、SELEX技術(shù)、RNA footprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNA pulldown技術(shù)。RNA pulldown技術(shù)利用脫末端標(biāo)記的RNA高效富集及鑒定RNA結(jié)合蛋白(RBPs)。
此方法避免了抗體的使用，大大延伸了使用范圍。隨著RNA pulldown技術(shù)的不斷完善，其在生命科學(xué)研究及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中扮演的角色愈加重要。NA pull-down實(shí)驗(yàn)就是先將RNA進(jìn)行標(biāo)記（如生物素探針標(biāo)記），再與細(xì)胞裂解液共同孵育，從而形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，之后再分離復(fù)合物得到蛋白質(zhì)，通過western blot 或mass Spectrometry檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。
目前RNA pull-down技術(shù)已成為研究miRNA、lncRNA與相互作用蛋白的主要技術(shù)手段之一?，F(xiàn)如今的研究中，RNA pulldown研究的探針主要是合成生物素標(biāo)記的單鏈探針，拓展了RNA的研究范圍。Tsai等通過改進(jìn)的RNA pulldown技術(shù)分析了長鏈非編碼RNA(lincRNA)調(diào)節(jié)染色體狀態(tài)和表觀遺傳。他們發(fā)現(xiàn)lincRNA HOTAIR作為至少兩個(gè)組蛋白修飾復(fù)合體的腳手架。HOTAIR的5’端結(jié)合多梳抑制復(fù)合體2(PRC2)，3’端結(jié)合LSD1/CoREST/REST復(fù)合體，完成RNA介導(dǎo)的RPC2和LSD1復(fù)合體的組裝從而完成H3K27和H3K4兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化。
RNA pulldown試劑盒使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。若待檢測目的蛋白明確，選擇Western blot鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜鑒定。
缺點(diǎn)：(1)實(shí)驗(yàn)中使用到的珠子(瓊脂糖珠子或磁珠)與蛋白的非特異結(jié)合，容易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性；(2)RNA探針與蛋白結(jié)合的特異性不高；(3)實(shí)驗(yàn)過程還會(huì)受到核酸酶污染的影響。
應(yīng)用[7]
RNA pulldown試劑盒可用于LncRNA-miRNA-mRNA相互作用的研究：
非編碼RNA依照其長度的不同可分為短鏈非編碼RNA、中等長度非編碼RNA以及長鏈非編碼RNA(Long no-coding RNA,LncRNA)。短鏈非編碼RNA長度小于50 nt,中等長度非編碼RNA長度介于50-200 nt,而長非編碼RNA長度大于200 nt。而且近年來研究表明,不同長度的RNA之間存在相互作用,特別是LncRNA與miRNA、miRNA與mRNA、lncRNA與mRNA都存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系,形成了lncRNA-miRNA-mRNA的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò),理清這一復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)于揭示RNA分子間的相互作用及闡釋其功能至關(guān)重要。
參考文獻(xiàn)
[1]Long noncoding RNA turnover[J].Je-Hyun Yoon,Jiyoung Kim,Myriam Gorospe.Biochimie.2015
[2]Long non‐coding RNA UCA1 promotes glycolysis by upregulating hexokinase 2 through the mTOR–STAT3/microRNA143 pathway[J].Zhengkun Li,Xu Li,Shouzhen Wu,Mei Xue,Wei Chen.Cancer Sci.2014(8)
[3]Urothelial carcinoma associated 1 is a hypoxia-inducible factor-1α-targeted long noncoding RNA that enhances hypoxic bladder cancer cell proliferation,migration,and invasion[J].Mei Xue,Xu Li,Zhengkun Li,Wei Chen.Tumor Biology.2014(7)
[4]Long noncoding RNA:an emerging paradigm of cancer research[J].Man-Tang Qiu,Jing-Wen Hu,Rong Yin,Lin Xu.Tumor Biology.2013(2)
[5]microRNA-21 overexpression contributes to cell proliferation by targetingPTEN in endometrioid endometrial cancer[J].Xiaoyan Qin,Lei Yan,Xingbo Zhao,Chunyan Li,Yibing Fu.Oncology Letters.2012(6)
[6]MicroRNA turnover:when,how,and why[J].Trends in Biochemical Sciences.2012(10)
[7]MicroRNA degradation and turnover:regulating the regulators[J].Zhuo Zhang,Yong‐Wen Qin,Gary Brewer,Qing Jing.WIREs RNA.2012(4)
[8]鄭偉.LncRNA-miRNA-mRNA相互作用初步研究[D].中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2017.