品牌：meilunstar

吖啶酯（NSP-SA-NHS）
分子式：C32H31N3O10S2  分子量：681.73
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
吖啶酯（NSP-SA-NHS）及其相關(guān)化合物已被證明是非常有優(yōu)勢(shì)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，其穩(wěn)定性、活性和敏感性超過了某些放射性同位素。吖啶酯能與含有一級(jí)氨基的蛋白發(fā)生反應(yīng)。在堿性條件下，NHS 作為離去基團(tuán)被取代，蛋白質(zhì)與吖啶酯形成穩(wěn)定的酰胺鍵。反應(yīng)完成后，多余的吖啶鹽通過脫鹽柱除去。
在存在堿性過氧化氫時(shí)，吖啶標(biāo)記的蛋白不需要酶催化可自行發(fā)光。具體發(fā)光原理是在堿性過氧化氫溶液中，吖啶酯受到過氧化氫離子的進(jìn)攻，生成一個(gè)有張力的不穩(wěn)定的二氧乙烷，進(jìn)一步分解成CO2和電子激發(fā)態(tài)的吖啶酮，當(dāng)吖啶酮回到基態(tài)時(shí)發(fā)出最大吸收波長(zhǎng)430nm的光子。這個(gè)發(fā)光過程是十分短暫（整個(gè)過程的發(fā)生小于2秒），觸發(fā)方案必須增加內(nèi)部光度計(jì)和光子探測(cè)器；另外，本產(chǎn)品也可以使用配備自動(dòng)進(jìn)樣器的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行發(fā)光數(shù)據(jù)采集。蛋白質(zhì)，多肽，抗體，核酸都可以用本產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)記。吖啶酯在堿性過氧化氫的激發(fā)下快速發(fā)光，因此通過收集光子可以檢測(cè)到標(biāo)記化合物。
本產(chǎn)品主要用于：化學(xué)發(fā)光及免疫分析、受體分析、核酸及多肽檢測(cè)等研究。
物理性狀及指標(biāo)：
外觀：……………………黃色粉末
含量：……………………≥95%

儲(chǔ)存條件：-20℃，充氮?dú)?，避光防潮密閉干燥
儲(chǔ)液配置：按表中溶解性配置；如溶解困難，可以通過快速攪拌，超聲或溫和加熱（在45-60°C下水?。?。-80°C 儲(chǔ)存時(shí)，請(qǐng)?jiān)?6 個(gè)月內(nèi)使用，-20°C 儲(chǔ)存時(shí)，請(qǐng)?jiān)?1 個(gè)月內(nèi)使用。

	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	1.4669 mL	7.3343 mL	14.6686 mL
5 mM	0.2934 mL	1.4669 mL	2.9337 mL
10 mM	---	---	---

數(shù)據(jù)展示

 
圖1.  (A)競(jìng)品對(duì)照的最大溶解度在DMSO為4mM，而美侖吖啶酯實(shí)測(cè)溶解度可以到15mM (10mg/ml)。圖A中兩管吖啶酯均為4mM DMSO 溶液，美侖與競(jìng)品對(duì)照外觀上沒有明顯差別。(B)多功能酶標(biāo)儀搭配自動(dòng)進(jìn)樣器（BioTek）檢測(cè)發(fā)光，設(shè)定接收信號(hào)濾波片460（±40）nm。2.5mg/ml DMSO溶液繼續(xù)使用DMSO稀釋500倍后（信號(hào)較強(qiáng)，防止燒壞儀器）至終濃度5ug/ml，取20ul 加到黑色96孔板并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，自動(dòng)進(jìn)樣器依次進(jìn)發(fā)光液100uL，同時(shí)記錄信號(hào)值。結(jié)果顯示相同濃度的吖啶酯DMSO溶液，美侖組的發(fā)光略強(qiáng)于對(duì)照公司。（吖啶酯發(fā)光液配制：0.01M NaOH+ 0.05% 過氧化氫）

圖2. 使用較高濃度（10mg/ml）吖啶酯DMSO溶液20uL，直接加入100uL吖啶酯發(fā)光液，可以發(fā)射出肉眼可見的藍(lán)光（430nm）。但是該信號(hào)衰減很快，整個(gè)發(fā)光時(shí)間僅有幾秒鐘，因此需要使用具有閃光型化學(xué)發(fā)光采集功能的儀器進(jìn)行信號(hào)采集。

 
圖3. 蛋白標(biāo)記效果測(cè)試。以吖啶酯標(biāo)記BSA為例，配制2.5mg/ml 吖啶酯 DMSO母液，溶有15mg/ml BSA 的0.2M碳酸氫鈉溶液(pH9.0)。為了充分標(biāo)記BSA，避免染料殘留對(duì)效果驗(yàn)證的影響，本次實(shí)驗(yàn)使用的染料摩爾數(shù)低于常規(guī)用量，按照染料母液：蛋白溶液=1：100 體積比，總體積1ML。室溫標(biāo)記1h后，過G25脫鹽柱，純化緩沖液為磷酸一氫鈉/磷酸二氫鈉 （1:1） 0.1M 混合體系，PH=6.7(鹽酸微調(diào))。結(jié)果顯示，相同的標(biāo)記濃度體系，同一個(gè)G25純化柱純化，吖啶-BSA 發(fā)光體系也設(shè)定相同，吖啶-BSA流出液的顏色美侖比競(jìng)品對(duì)照更深一些（圖A）。雖然標(biāo)記前，兩家的吖啶酯光強(qiáng)相似，但是標(biāo)記后，美侖的光強(qiáng)更有優(yōu)勢(shì)，比對(duì)照高一個(gè)數(shù)量級(jí)（圖B），說明蛋白標(biāo)記對(duì)美侖組的吖啶發(fā)光基團(tuán)的影響最小，并且美侖的吖啶酯在堿性標(biāo)記蛋白質(zhì)過程中也更加穩(wěn)定，優(yōu)于競(jìng)品對(duì)照！

使用說明（舉例抗體/蛋白質(zhì)標(biāo)記）：

1.配制   

標(biāo)記緩沖液：0.2M NaHCO3  (pH=9.0)；
標(biāo)記終止緩沖液： 10% 賴氨酸  0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液；
脫鹽純化緩沖液：0.1M Na2HPO4-NaH2PO4  (pH=6.5)；
吖啶酯發(fā)光液：(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2 。

2. 計(jì)算標(biāo)記所用抗體（蛋白質(zhì)）和吖啶酯的量：
通常設(shè)定摩爾比n(抗體): n(吖啶酯)=1:10~1:50，具體需根據(jù)氨基酸組分進(jìn)行摸索調(diào)整；
配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液，注意玻璃器皿盛放并避光；
使用0.2M NaHCO3（pH=9.0） 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗體反應(yīng)液 。

3. 連接及純化
本說明書舉例針對(duì)標(biāo)記抗體抗體的分子量為 180kd 對(duì)應(yīng) 15 倍的吖啶酯。如果用戶的待標(biāo)記樣品是其他的分子量，請(qǐng)參考附表 1 改變?cè)噭┑呐浔取?br>1．取 10 μL 稀釋吖啶酯母液 (2.5mg/ml)，加入 90 μL 無水 DMSO(or DMF) 稀釋10倍，配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。
2．使用0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液稀釋 50μg 的抗體至 300 μL，加入 10 μL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)（參考附表 1）。
3．錫箔紙包好，室溫標(biāo)記0.5~1h。
4．淬滅反應(yīng)，加入 100 μL 標(biāo)記終止緩沖液，室溫混勻 30 分鐘（注：如果標(biāo)記較充分，也可以跳過此步驟，直接進(jìn)行柱純化）。
5. 脫鹽柱純化，收集吖啶標(biāo)記蛋白組分并檢測(cè)濃度，請(qǐng)參考說明書后文。
6．檢測(cè)標(biāo)記的蛋白，取10μL吖啶標(biāo)記蛋白，放于黑色96孔板中，向每個(gè)微孔注入 50 μL~150μL吖啶酯發(fā)光液，立即檢測(cè)，如果發(fā)光過強(qiáng)，可以對(duì)標(biāo)記蛋白再進(jìn)行若干倍的稀釋，使其在儀器的發(fā)光檢測(cè)限內(nèi)。注：吖啶酯發(fā)光液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，或者將NaOH溶液和過氧化氫溶液分別配成2x母液，使用的時(shí)候再1：1進(jìn)行混合。
7．吖啶酯標(biāo)記的蛋白可以在酸性緩沖液中4℃避光存儲(chǔ)（注意補(bǔ)加疊氮鈉等防腐劑），如果儲(chǔ)存效果不佳，則請(qǐng)避光保存于-20℃或者-80℃。

注意事項(xiàng)：

1.吖啶酯除了DMF，也可以用無水DMSO等非質(zhì)子性溶劑來溶解。通常吖啶酯用DMF最高溶解的濃度為4mM (約2.7mg/ml)，我司生產(chǎn)的吖啶酯中DMSO中溶解度可達(dá)10mg/ml。
2.標(biāo)記前，由于吖啶酯末端羧基經(jīng)NHS活化,較為活潑，請(qǐng)用非質(zhì)子性的干燥無水溶劑來溶解；標(biāo)記后，標(biāo)記后吖啶酯與被標(biāo)記物之間以酰胺鍵或者酯鍵等形式存在，酸性溶劑基本沒有影響；吖啶酯本身活性位點(diǎn)在堿性和氧化環(huán)境下不穩(wěn)定，因此應(yīng)根據(jù)被標(biāo)記物的穩(wěn)定性配制相應(yīng)的非強(qiáng)堿性非氧化的體系中處理和保存。
3.發(fā)光標(biāo)記物在光照條件下有可能部分分解，以致影響發(fā)光效果。吖啶酯的實(shí)驗(yàn)操作和儲(chǔ)存建議避光條件下處理，目前暫時(shí)沒有具體的研究數(shù)據(jù)。
4.吖啶酯標(biāo)記蛋白等大分子化合物建議用G25脫鹽柱分離；吖啶酯標(biāo)記小分子化合物建議用柱層析分離;
5.吖啶酯發(fā)光過程是十分短暫（整個(gè)過程的發(fā)生小于2秒），觸發(fā)方案必須增加內(nèi)部光度計(jì)和光子探測(cè)器；另外，本產(chǎn)品也可以使用配備自動(dòng)進(jìn)樣器的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行發(fā)光數(shù)據(jù)采集，最大限度降低加樣時(shí)間對(duì)采集信號(hào)的影響。
6.吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀器推薦：
美國(guó)PE公司的 Wallac 1420 多功能檢測(cè)儀,
德國(guó)西門子拜耳化學(xué)發(fā)光儀ADVIA Centaur

附表 1： 吖啶用量對(duì)照表

吖啶酯標(biāo)記蛋白效率計(jì)算方法
1. 取100uL 待測(cè)樣品，稀釋至Abs280在0.1~1.5之間；
2. 向1中加入少量鹽酸，調(diào)整至pH=1~2，使其形成具有黃色特征的鹽溶液，吸收峰在367nm
3. 分別測(cè)試待測(cè)樣品的Abs280nm 和Abs367nm ；
4. Equation1: 吖啶酯濃度(mol/L)=Abs367/14650 ；
5. 校正蛋白Abs280數(shù)值
Equation2: Abs280(校正后) = Abs280- (Abs367×0.17);
6. 準(zhǔn)備1mg/ml 未標(biāo)記的蛋白溶液（e.g. 50ug 蛋白加入50μL 標(biāo)記緩沖液），取出10μL 并補(bǔ)加490μL ddH2O (稀釋50倍)。讀取Abs280nm ，并乘以稀釋倍數(shù)。
7. 計(jì)算蛋白質(zhì)量濃度（mg/ml）
     Equation3:蛋白摩爾濃度 （mol/L）
8. 計(jì)算F/P摩爾比