53-79-2
中文名稱
嘌呤霉素二鹽酸鹽水合物
英文名稱
PUROMYCIN
CAS
53-79-2
分子式
C22H29N7O5
分子量
471.51
MOL 文件
53-79-2.mol
更新日期
2024/12/12 14:13:41
53-79-2 結(jié)構(gòu)式
基本信息
中文別名
嘌呤酶素嘌呤霉素
嘌呤霉素(源頭工廠)
嘌呤霉素二鹽酸鹽水合物
嘌呤霉素二鹽酸鹽水合物(嘌呤霉素)
英文別名
1-mm3123l
p-638
C01610
cl16536
cl13,900
nsc-3055
PUROMYCIN
Stylomycin
achromycin
所屬類別
原料藥：其它抗生素類藥物理化學性質(zhì)
熔點175.5-177°
比旋光度D25 -11° (ethanol)
沸點572.65°C (rough estimate)
密度1.3119 (rough estimate)
RTECS號AU7350000
折射率1.7010 (estimate)
酸度系數(shù)(pKa)6.8, 7.2(at 25℃)
形態(tài)液體
水溶解性Soluble in water (50 mg/ml at 20°C).
安全數(shù)據(jù)
警示詞警告
危險性描述H302
危險品運輸編號3249
危險等級6.1(b)
包裝類別III
毒性LD50 in mice (mg/kg): 350 i.v.; 525 i.p.; 675 orally (Porter, 1952)
常見問題列表
理化性質(zhì)
嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，分子式C22H29O5N。無色晶體，熔點175～177℃，水溶液對石蕊呈堿性。通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陽性和陰性細胞以及錐蟲、阿米巴原蟲和腫瘤細胞等都有抑制作用。嘌呤霉素主治阿米巴感染，也可治療某些腫瘤病。嘌呤霉素篩選
嘌呤霉素（Puromycin）常用于篩選能夠表達pac基因的細胞。pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果表達該基因，就會對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達pac基因的哺乳動物穩(wěn)定細胞株。目前，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標記為 puror)，可以利用嘌呤霉素的篩選，得到特定基因穩(wěn)定表達的細胞株。Puromycin不僅能用于穩(wěn)定細胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細胞株的維持。Puromycin的作用特點是快速作用于細胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達pac基因的細胞。篩選原理
作用原理是因其具有與tRNA分子中腺苷相連結(jié)的氨基酸末端類似的結(jié)構(gòu), 能夠同氨基酸結(jié)合，代替氨酰化的tRNA同核糖體的A位點結(jié)合，并摻入到延伸的肽鏈中。雖然嘌呤霉素能夠同A位點結(jié)合,但是不能參與隨后的任何反應(yīng), 因而導致蛋白質(zhì)合成的終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。嘌呤霉素對原核和真核生物的翻譯過程均有干擾作用。嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAC），賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達細胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期等均有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達的細胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染細胞的最低嘌呤霉素濃度至關(guān)重要。初次做實驗一定要建立適合自身實驗體系的殺滅曲線。若細胞對嘌呤霉素耐受性較高，則可能需要大于常規(guī)濃度。
相關(guān)研究
嘌呤霉素可引起足細胞損傷，機制還不是非常清楚，有研究認為嘌呤霉素可能是通過引起足細胞氧化應(yīng)激損傷，導致足細胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)紊亂，超氧化物增加。不過嘌呤霉素仍常常被用來構(gòu)建腎病大鼠模型，該模型是研究微小病變型腎病(MCNS)和局灶節(jié)段性腎小球硬化的理想動物模型l。但是目前尚未見到利用嘌呤霉素體外構(gòu)建足細胞損傷的模型，特別是利用該模型研究足細胞相關(guān)蛋白尿發(fā)生的分子機制的報道，而且由于研究目的不同，所用嘌呤霉素的劑量和處理時間也不盡相同。有研究發(fā)現(xiàn)45mg/L嘌呤霉素處理48h后，足細胞發(fā)生了明顯凋亡，而與75mg/L嘌呤霉素相比，盡管處理時間延長了，但是嘌呤霉素的使用劑量減少了近一半，比較經(jīng)濟；同時利用MTT實驗檢測了45mg/L嘌呤霉素處理48h后足細胞的活力情況，發(fā)現(xiàn)足細胞的活力也明顯減弱，裂孔隔膜關(guān)鍵分子Nephrin和Podocin的表達發(fā)生明顯改變，細胞骨架分布紊亂、解聚，因而體外建立嘌呤霉素致足細胞損傷的細胞模型時，使用45mg/L的嘌呤霉素處理小鼠足細胞48h是比較合適的選擇。使用方法
1. 建議使用濃度哺乳動物細胞：1-10 μg/mL，最佳濃度需要殺滅曲線來確定;
大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125μg/mL。注：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細胞本身的影響。
2.溶解方法
用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存;也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的儲存液。
3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導為例)
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達的shRNA細胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導細胞的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線(kill curve)。
1)Day 1：24孔板內(nèi)以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔以進行后續(xù)的梯度實驗。37℃細胞孵育過夜;
2)Day 2：
a)準備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0-15μg/mL，至少5個梯度);
b)往孵育過夜后的細胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基;之后37℃孵育細胞;
3)Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細胞存活率。
4)根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基;
5)每日監(jiān)測細胞，觀察存活細胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非轉(zhuǎn)導細胞的藥物最低濃度。
4. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選
等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。
1)細胞轉(zhuǎn)染48h后，將細胞(原樣或稀釋)置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
注意：當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用最明顯。細胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。最好進行細胞分盤使其密度不超過25%。
2)每隔2-3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
3)篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。注意：每日進行細胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
4)轉(zhuǎn)移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細胞毒性實驗做準備。